Interacción Rotavirus – PDI

Para determinar si existe interacción entre PDI y el rotavirus, se realizó un ensayo de unión entre PDI soluble y TLPs de la cepa RRV y Wa. La presencia del complejo proteico rotavirus-PDI se estableció mediante “Western blotting” y ELISA de captura.

El análisis por “SDS-PAGE/Western blotting” de la mezcla PDI TLPs de RRV que fue precipitada a través del colchón de sacarosa por centrifugación a 133.000 x g, muestra a PDI junto con las TLPs.

Este resultado sugiere que existe una interacción entre las TLPs y la PDI, dado que la presencia de PDI en el precipitado del fondo del tubo solo es posible si se encuentra asociada a las partículas virales, las cuales poseen un coeficiente de sedimentación que explica su transporte hasta el fondo del tubo en las condiciones de centrifugación utilizadas en este experimento. (Lea también: Anticuerpos anti-PDI disminuyen la Infección por Rotavirus)

Figura 7. PDI está presente en los microdominios lipídicos Rafts. En A, células MA104 lisadas a 4°C con buffer Tris-NaCl, TritónX100 1% y centrifugadas en un gradiente de sacarosa (5-40%). En B, como control, células tratadas con -metilciclodextrina 10mM antes de lisarlas.

Las fracciones recuperadas del gradiente fueron tratadas con octil-glucósido 0,2%, -metilciclodextrina 10mM, con incubación 1h a 37°C. 30 μl de cada fracción fue separada por SDS-PAGE, transferidas a membrana PVDF y ésta revelada con anticuerpos Anti- PDI y Anti-Hsc70, y el sistema fostatasa alcalina-NBT/BCIP.

En C, las fracciones se inmunoprecipitaron con Anti-PDI, se separaron por SDS-PAGE, fueron transferidas a membrana de PVDF, la membrana se reveló con anticuerpos contra las proteínas Hsc70 e integrina 3, y peroxidasa-luminol.

En D, ELISA de captura con Anti-PDI de cada una de las fracciones, las proteínas se detectaron con Anti-Hsc70, Anti-Integrina 3 y Anti-ERp57, la placa fue revelada con el sistema peroxidasa-OPD. El delta de absorbancia es la diferencia después de restar el promedio de los pozos sin antígeno.

La PDI aislada, tiene un coeficiente de sedimentación mucho mas bajo que el de las TLPs, el cual no le permitiría sedimentar a través del colchón de sacarosa sometido al campo centrifugo aplicado (Fig. 8A). Mediante ELISA de captura se encontró a PDI en interacción con las TLPs cuando se utilizó alternativamente anti-PDI y anti-rotavirus para capturar los complejos proteicos (Fig. 8B).

Esta interacción disminuyó cuando la reacción se hizo en presencia de DTNB (Fig.8C), sugiriendo que en dicha interacción puede estar interviniendo el motivo catalítico redox de la PDI, sin descartar alguna interacción de tipo chaperona.

Las células Caco-2 se marcaron en sulfo- NHS-SS-biotin, como se describió anteriormente para las células MA104, se adicionó virus Wa y se incubó por 40 minutos a 4°C, se dejaron15 minutos más a temperatura ambiente y luego se lisaron las células.

Al lisado celular se le adicionó Avidina-agarosa con el objeto de separar las proteínas que incorporaron el sulfo-NHS-SS-biotin; las proteínas aisladas con avidina-agarosa fueron analizadas por “Western blotting” (Fig. 8D). Los resultados señalan la presencia de PDI superficial, la cual fue marcada con biotina, aislada con avidina-agarosa y detectada con avidina-HRP y anticuerpos anti-PDI.

Además PDI estaría interactuando con el rotavirus Wa, ya que se detectó al menos una proteína de éste cuando la misma membrana fue revelada con anticuerpos anti-rotavirus y el conjugado de fosfatasa-alcalina (Fig. 8D).

Para determinar la existencia de grupos tioles libres en el complejo PDI-rotavirus, se utilizó EZ-link Maleimide PEO2-Biotin, un reactivo que forma un enlace tioeter con los grupos tioles libres, esta reacción es medible por la incorporación de biotina. El EZ-linkMaleimide PEO2-Biotin se adicionó simultáneamente con el virus a las células en presencia y ausencia de DTNB.

El lisado celular se examinó en ELISA, capturando los respectivos antígenos con anti-rotavirus (Fig. 9A) o con anti-PDI (Fig. 9B), seguido de la detección con los anticuerpos recíprocos correspondientes, los resultados nuevamente reafi rman la interacción entre la PDI y el rotavirus.

La incorporación de biotina fue medida cuando los antígenos se detectaron con avidina-HRP. Se observan diferencias en la cantidad de biotina incorporada por los complejos protéicos PDI-rotavirus en presencia o ausencia de DTNB; la presencia de este inhibidor redujo la incorporación de biotina, debido a una menor disponibilidad de grupos tioles.

Este ensayo muestra que hubo incorporación de biotina sobre el complejo protéico rotavirus-PDI, indicando la presencia de proteínas con cisteínas accesibles a la alquilación dentro del complejo que incluye a PDI y al rotavirus