El proceso infeccioso del rotavirus en células MA104 se interfi ere al inhibir la actividad disulfuro isomerasa de la superficie celular.
Se evaluó el efecto de agentes bloqueadores de las reacciones de intercambio tiol(-SH)/disulfuro (S-S-) sobre la membrana de células MA104 durante el proceso infeccioso del rotavirus. Este efecto fue medido usando dos reactivos que no son internalizados por la célula, el DTNB y la bacitracina.
La infección del rotavirus se midió mediante inmunocitoquimica, como unidades formadoras de foco (UFF). (Lea también: Modificación de los grupos tiol sobre la superficie celular)
La infección disminuyó hasta un 70 y 75% cuando se adicionó 30 mM de DTNB y 20 mM de bacitracina, respectivamente, siendo el efecto inhibitorio dependiente de la concentración de reactivo. Las cepas rotavirales (RRV, Wa y YM) evaluadas se comportaron de forma similar en las pruebas de inhibición de la infección con los bloqueadores de la actividad disulfuro isomerasa en las células MA104 (Fig. 1A, B y C).
La viabilidad de las células medida por exclusión de azul de Tripán y por ensayo de MTT no se vio afectada por el DTNB en las concentraciones analizadas, mientras que la bacitracina afecta el 100% de la viabilidad de las células MA104 a 40 mM (Fig. 2A). Las células Caco-2 mostraron mayor susceptibilidad a la bacitracina ya que a concentra ciones superiores 1 mM, tienden a desprenderse después de 12 horas de incubación.
Dado que al bloquear la actividad disulfuro isomerasa sobre la superficie celular de las células MA104 se inhibe el proceso infeccioso del rotavirus, se quiso determinar el momento del proceso infeccioso en el cual la actividad del intercambio tiol-disulfuro está implicada.
Para esto, las células se incubaron con 30 mM de DTNB por 30 minutos a 37ºC, luego de este tiempo a una parte de las células se les removió el DTNB por lavados con medio y se procedió a infectarlas con los rotavirus RRV y Wa. Otras células fueron tratadas simultáneamente con el inhibidor y el virus.
Los porcentajes de infección obtenidos bajo estas condiciones, indican que la infección rotaviral disminuye hasta un 70% cuando se realiza incubación previa con DTNB o es adicionado simultáneamente junto con el virus.
Figura 1. Efecto inhibitorio de la infección rotaviral en células MA104 por bloqueadores de la actividad tiol-disulfuro de la membrana celular. Las monocapas celulares fueron incubadas en presencia y ausencia de las concentraciones indicadas de DTNB y bacitracina e infectadas por rotavirus (A. cepa RRV; B. cepa Wa y C. cepa Ym), con MOI 0,5 (0.5 partículas virales por célula). El porcentaje de infección se midió cuantifi cando el virus como unidades formadoras de foco (UFF) mediante inmunocitoquimica con anti-rotavirus hecho en conejo, y anti-conejo peroxidasa (HRP)-aminocarbazol.
Cuando se retira el inhibidor con lavados antes del reto viral, se reestablece la infección hasta el 86%. Se obtuvo un porcentaje de infección del 83% cuando el DTNB se adicionó a las células en el periodo de post-adherencia, es decir, una hora después de ser éstas infectadas con el rotavirus.
Este resultado indica que este tipo de inhibidor, que no atraviesa la membrana, no altera el proceso de replicación del rotavirus una vez éste se ha internalizado (Fig. 3A).
Para determinar si la acción del inhibidor es hacia las células o hacia el virus, una dosis concentrada de rotavirus fue incubada con 30 mM de DTNB y luego fue diluida hasta 1,5 mM al momento del reto con las células; bajo estas condiciones la infección rotaviral fue del 93% indicando que el inhibidor no actúa sobre las proteínas virales (Fig. 3A). Ambas cepas rotavirales se comportaron de forma similar en estos experimentos, excepto que la cepa Wa disminuyó su infectividad alrededor de un 20% después del tratamiento de las particulas virales con DTNB, sugiriendo que posiblemente presente en sus proteínas estructurales grupos tiol disponibles para la reacción redox.
La actividad disulfuro isomerasa no parece ser necesaria en el proceso inicial de unión (adherencia) del rotavirus a la célula, ya que al adherir el virus a 4ºC por una hora en presencia de DTNB o de bacitracina, no se detectaron diferencias apreciables en la cantidad de virus unido al comparar con monocapas celulares no tratadas (Fig. 3B).
Figura 2. Viabilidad de células MA104 (A) y Caco-2 (B) infectadas por rotavirus RRV, medida a las 12 horas de infección por ensayo MTT en presencia de DTNB, bacitracina.
Estos resultados sugieren que el DTNB actúa sobre proteínas celulares e interfiere la infección de las células durante el proceso de entrada del rotavirus, en un paso posterior a la unión virus-célula pero anterior a la internalización del virus.
