Interferencia de la Infección por Rotavirus, Materiales y Métodos

Líneas celulares y cepas de rotavirus

La infección rotaviral se analizó en las líneas celulares MA104 y Caco-2. Las cepas rotavirales analizadas fueron: Wa (origen humano), RRV (origen simiano) y Ym (origen porcino) procedentes del laboratorio del Doctor Carlos Arias, de la Universidad Autónoma de México.

El rotavirus fue propagado en células MA104, previo tratamiento del virus con 10 μg/ml de tripsina a 37° C por 30 minutos y con adiciónde 10 mM de CaCl2, justo antes de ser inoculado a las células MA104 (Pando V., 2002).

El lisado celular se congeló y se descongeló con el fin de liberar el virus intracelular y el adherido a la membrana. El lisado celular infectado fue titulado y almacenado a -70°C en alícuotas hasta su uso. (Lea también: Interferencia de la Infección por Rotavirus, Introducción)

Purificación y modificación de partículas virales

Las partículas virales (TLPs) se purificaron mediante extracción con Freón, centrifugación diferencial seguida de separación en gradientes discontinuos de sacarosa y CsCl en buffer TNC (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 10 mM, pH 7.5) (Pavel, I., 2004), colectando las bandas que contenían las TLPs y DLPs.

Alternativamente, una alícuota de la preparación viral antes de ser colocada en los gradientes discontinuos de sacarosa y CsCl, se trató con 55 mM de iodoacetamida en buffer TNC, con el fin de alquilar cualquier cisteína libre y accesible en la partícula viral (Cuadras et al., 1998).

Titulación viral e inmunocitoquimica

El lisado de células infectadas con las cepas de rotavirus y las TLPs se titularon para establecer la dilución viral que permitiera obtener alrededor de 100 unidades formadoras de foco (UFF) (relación de unidades infecciosas por célula) a lo largo del campo de observación con el microscopio invertido en un aumento 20X; con esa dilución se realizaron los ensayos de infectividad.

Células MA104 confluentes se infectaron con diluciones seriadas del lisado viral previamente tratado con tripsina. Después de una hora de adsorción del virus, las células fueron incubadas con MEM (Medio Mínimo Esencial de Eagle) por 12 h a 37°C.

Las células fueron pre-enfriadas y fijadas en metanol por 45 min a 4°C. Para el ensayo inmunocitoquímico se adicionó un suero policlonal contra rotavirus preparado en conejo (producido en nuestro laboratorio), se incubó por 1 h a 37°C, seguido de tres lavados con PBS (buffer fostafo salino: Cloruro de Potasio 2.7 mM, Fosfato de Potasio 1.8 mM, Cloruro de Sodio 137 mM, Fosfato de Sodio 10 mM).

Como anticuerpo secundario se utilizó anti-conejo conjugado con peroxidasa (Santa Cruz Biotechnology). La placa se reveló con aminoetilcarbazol 0.25 mg/ml en 50 mM de buffer de acetato de sodio pH 5.2 y peroxido de hidrógeno al 0.04%

Estudio de Inhibidores de la actividad disulfuro isomerasa en ensayos de infección con rotavirus

La función de la PDI fue inhibida por los reactivos químicos DTNB y bacitracina (Sigma St Louis, MO, U.S.A), a los cuales es impermeable la membrana celular. Previamente se determinaron las dosis no tóxicas de estos reactivos durante todo el proceso de infección celular mediante los métodos de azul de Tripan y MTT [3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)-2-5-difeniltetrazolium].

Para determinar el efecto de los inhibidores sobre la infección viral, monocapas celulares distribuidas en placas de 96 pozos, se incubaron con diferentes concentraciones de los inhibidores por 30 minutos a 37°C, se adicionó el virus y se continuó con el proceso de infección e inmunocitoquimica. Cada experimento se realizó por duplicado, repitiéndose tres veces.

El 100% de infección corresponde a células infectadas en ausencia de inhibidor. La etapa del evento infeccioso afectada por los inhibidores DTNB y bacitracina se determinó modificando los tiempos y temperaturas de incubación de la siguiente manera:

(a) adicionando los inhibidores a las células e incubando por 30 min y luego retirándolos con lavado antes del desafío con el virus,

(b) dejando los inhibidores permanentemente durante todo el experimento,

(c) adicionándolos simultáneamente con el virus, y

(d) adicionándolos una hora después del inicio de la etapa de post-entrada.

Para determinar el efecto de los inhibidores sobre el virus, éste se incubó con 30mM de DTNB por 30 minutos a 37ºC, seguido de dilución de la mezcla virus-DTNB hasta obtener una concentración 1.5 mM de DTNB y un MOI de 0.5.

Esta mezcla diluida se incubó con las células a 37°C por 12 h como se describió anteriormente. Para los ensayos de unión virus-célula, las células se preincubaron con los inhibidores a 37ºC; luego este complejo se enfrió sobre hielo por 5 minutos y se adicionó el virus preenfriado; el complejo virus-célula se incubó a 4ºC por 1 h. Las células se lavaron con MEM preenfriado, se lisaron y el virus unido fue medido mediante ELISA de captura.

Para determinar el efecto especifico de la actividad de PDI sobre la infección rotaviral, las células se preincubaron durante 30 minutos a 37°C, con los anticuerpos anti-PDI (Mouse IgG1 monoclonal – Stressgen), anti-PDI (Goat polyclonal IgG), anti-ERp57 (Goat polyclonal IgG), anti-Calregulin (rabbit polyclonal IgG) anti-calnexin (rabbit polyclonal IgG), todos ellos obtenidos de Santa Cruz.

Como control, se utilizaron células incubadas con un anticuerpo irrelevante (isotipo). Las células fueron retadas con el virus y se continuó con el proceso de infección durante 12 horas, como se describió anteriormente.

Localización de PDI sobre la membrana celular

Para detectar la presencia de la PDI en la membrana citoplasmática mediante inmunofl uorescencia, las células se sembraron en laminillas hasta confluencia de 80%, se fi jaron con paraformaldehído al 4%, se incubaron con el monoclonal anti-PDI IGg1 monoclonal (Stressgen) a 4 μg/ml y con el anticuerpo secundario anti-ratón-FITC (Santa Cruz Biotechnology). Se detectó la fl uorescencia en un microscopio VanGuard 1486 FL, comparando la intensidad de las células tratadas con aquellas del control.

Estos resultados se corroboraron mediante el uso de citometría de flujo en un FACSCalibur (BD Biosciences). Para esto, 5 x 105 células se trataron con PBS 1X – EDTA 2 mM para obtenerlas en suspensión y fueron mantenidas a 4ºC; se incubaron con 4 μg/ml de anti-PDI monoclonal (Stressgen) diluido en MEM-BSA al 1%. Como anticuerpo secundario se utilizó anti-ratón-FITC disuelto en PBS-BSA al 1%. Otra fracción celular se trató con 7-AAD (7 amino-actinomicina D) (Pharmingen) como control de viabilidad.

Para confi rmar la presencia de PDI asociada a la membrana, se realizó el marcaje con biotina de las proteínas asociadas a la superficie externa de la membrana celular, con el reactivo reversible Sulfo NHS-SS-Biotin (Pierce) siguiendo las indicaciones del fabricante.

Brevemente, las monocapas celulares dispuestas en placas de seis pozos, se lavaron con PBS frío para retirar todas aquellas moléculas con grupos amino libres. Se adicionó una solución 5mM de Sulfo NHS-SS-Biotin, se incubó por 30 minutos, se agotó el reactivo en exceso con tris-HCl 20 mM, se realizó la lisis celular y se aislaron las proteínas biotiniladas con agarosa-avidina.

Las proteínas inmovilizadas por la agarosa-avidina, y aquellas presentes en el sobrenadante, se separaron mediante electroforesis desnaturalizante bajo condiciones reductoras y no reductoras, con el objeto de detectar la biotina incorporada a las proteínas en ausencia del agente reductor 2-mercaptoetanol (2- ME).

Las proteínas separadas electroforeticamente a una membrana de PVDF y el “Western blot” se analizó con avidina-HRP (peroxidasa de rábano) y anticuerpos anti-PDI. Otra fracción de este lisado celular biotinilado fue analizado por ELISA de captura utilizando alternativamente anticuerpos anti-PDI generados en conejo o proteína avidina para capturar la proteína biotinilada, la detección del complejo capturado se realizó con avidina- HRP, y anticuerpos anti-PDI, respectivamente.

Localización de PDI en los microdominios lipídicos “rafts”

Las células MA104 (1 x 107) se trataron con buffer de lisis (50mM de Tris-HCl pH 7.5, 150 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 2 mM de DTT y 1% de Triton X-100) en presencia de 2 mM de PMSF (fenilmetil sulfonilfl uoruro) (Sigma) y 1mM de EDTA a 4ºC.

El lisado se sometió a centrifugación en un gradiente lineal de sacarosa (5-40%) a 4°C. Como control se utilizó una preparación derivada de células tratadas con 10 mM de metil -ciclodextrina (Sigma, St Louis, MO, U.S.A) por 1 hora a 37°C, con el objeto de secuestrar el colesterol para desestabilizar los microdominios “rafts” (Isa et al., 2004).

Después de la centrifugación se tomaron fracciones sucesivas de 500 μl iniciando desde la parte superior del tubo y terminando en el fondo; cada fracción fue tratada con 0.2% de octil glucósido, 1% de Tritón X-100, y 10 mM de metil- -ciclodextrina durante 30 min a 37°C para deshacer los “rafts” y permitir evaluar la interacción proteína-proteína. Estas fracciones fueron analizadas por “SDS-PAGE-Western Blotting”, co-inmunoprecipitación y ELISA de captura.

La co-inmunoprecipitación se realizó adicionando a las diferentes fracciones procedentes del gradiente de sacarosa, anticuerpos policlonales anti-PDI, incubándolos por 1 hora a 37°C. El complejo antigeno-anticuerpo fue inmunoprecipitado con proteína A-sepharosa (Biorad).

El inmunoprecipitado se analizó por “SDS-PAGE-Western blotting”, incubando la membrana con anticuerpos anti-integrina 3 y anti-Hsc70. Para el ELISA se utilizó como anticuerpo de captura anti-PDI generado en conejo; cada fracción del gradiente de sacarosa tratada con los detergentes como se indicó antes, se adicionó a las placas de ELISA y se realizó la detección de los complejos protéicos con los anticuerpos anti-ERp57, anti-3 y anti-Hsc70, todos ellos generados en cabra. Las reacciones de los anticuerpos fueron reveladas mediante el sistema de conjugado- peroxidasa-OPD.