Interferencia de la Infección por Rotavirus, Discusión

Las proteínas PDIs se han visto implicadas en importantes procesos biológicos en sitios diferentes al RE, aunque no se conoce mucho acerca de las funciones y los mecanismos de acción de las PDIs, en esos sitios. Al menos tres proteínas de esta familia en mamíferos han sido encontradas en la superficie celular, el espacio extracelular, el citosol y el núcleo (Essex et al 1995; Turano, C. 2002).

A nivel de la membrana celular la PDI ha sido encontrada en diferentes células, entre ellas plaquetas activadas, hepatocitos, páncreas exocrino, células endoteliales, linfocitos CHO, BHK (Chen et al., 1992; Terada et al., 1995; Yoshimori et al., 1990; Hotchkiss et al., 1998). (Lea también: Péptidos Sintéticos con cisteínas de secuencias rotavirales inhiben la infección en células MA104)

En este trabajo reportamos, por primera vez, que PDI se localiza en la membrana citoplasmática de las células MA104 y Caco-2, permisivas a la infección por rotavirus, en una concentración muy inferior a la encontrada al interior de la célula (Fig 4C).

La presencia de PDI en estos sitios puede darse por un mecanismo aún no elucidado de exportación, existiendo rápidamente recambio de ésta; sin embargo, su función en membrana citoplasmática no está aún completamente determinada aunque sigue estando relacionada con las propiedades redox (Schwaller et al., 2003).

La PDI asociada a la superficie celular está implicada en la reducción de los puentes disulfuro de la toxina de la difteria, que por esta vía adquiere la capacidad de entrar en la célula y desplegar su actividad citotóxica (Mandel et al., 1993).

Está relacionada con cambios estructurales de las proteínas de diferentes virus, para un exitoso proceso infectivo a las células:

En el caso del virus HIV-1, los cambios conformacionales en la envoltura lipídica del HIV (Env), dependen de la acción coordinada de un sistema tripartita en el cual la PDI trabaja concertadamente con el receptor y correceptor, CD4 y CXCR4 respectivamente, al parecer inmersos en microdominios lipídicos “rafts” que sirven de plataforma y facilitan el proceso de entrada del virus (Markovic et al., 2003, Ou y Silver., 2006).

Virus como el Sindbis, el baculovirus y vaccinia también dependen de la actividad disulfuro isomerasa para la entrada a la célula, aunque el mecanismo catalítico del intercambio tiol/disulfuro en éstos no ha sido definido (Abell BA, et al.. 1993; Markovic et al., 1998; Locker et al., 1999).

En células MA104 y en las Caco-2, nosotros localizamos a PDI en los microdominios “rafts” de la membrana celular, formando complejos proteicos con los receptores de rotavirus, las proteínas Hsc70 e integrina v3. HSC70 ya ha sido reportada en los microdominios raft en células MA104 (López S 2006, Isa P. 2004), sin embargo la característica del complejo proteíco PDI-Hsc70 y av3 es la primera vez que se reporta.

El rotavirus en su proceso de ensamblaje hace uso de las “chaperonas” residentes en el retículo endoplasmatico para plegar sus proteínas estructurales, la conformación de la proteína VP7 es altamente susceptible a la inactivación de la proteína disulfuro isomerasa, ya que este proceso inhibe la formación de los puentes disulfuro nativos de VP7 y por ende se inhibe el ensamblaje del virus, observándose este efecto como acumulación de DLPs en el lumen del reticulo endoplasmatico (Svensson et al., 1994; Mirazimi et al. 1998, Delmas, et al., 2004; Maruri-Avidal, et al., 2008).

Dado que ese remodelaje de las proteínas estructurales a nivel de grupos tioles es importante para el ensamblaje el virus:

En este trabajo quisimos explorar si para la interacción con los receptores celulares, en el proceso de internalización, este proceso redox también está implicado.

Los resultados mostraron que la inhibición de la actividad disulfuro isomerasa de la superfi cie celular mediante DTNB y bacitracina disminuye la infección rotaviral en un modelo dosis dependiente y con un perfil saturable, sugiriendo que el rotavirus requiere de intercambios tiol-disulfuro en el transcurso de la infección celular.

El diseño experimental realizado indicó que la interacción del rotavirus mediada por grupos tioles transcurre en los eventos iniciales del proceso infeccioso en una etapa de pos-adherencia, ya que ni el DTNB ni la bacitracina impidieron la unión del virus a las células.

Además, no hubo variación de los porcentajes de infección comparados con células infectadas sin tratamiento, cuando estos reactivos se adicionaron en la etapa de post-entrada.

Más aun, los inhibidores no afectan el estado redox de las TLPs de RRV ya que al adicionarse a éstas, el porcentaje de infección celular fue comparable al de las partículas sin tratar.

Este resultado y el hecho que las TLPs de RRV no reaccionaran con el reactivo EZ-link Maleimide PEO2-Biotin indican la naturaleza oxidada de las proteinas virales. Cuando las células se incubaron con DTNB y luego éste fue removido por lavados antes del reto con el virus, se observó que la infección celular alcanzó porcentajes

La inhibición de la infección rotaviral, en células MA104:

En presencia de anticuerpos anti-PDI fue dosis- dependiente y como en el caso del DTNB mostró un perfi l saturable, con una inhibición del 90% a 10 μg/ml de anticuerpo anti-PDI. La inhibición por bloqueo de la PDI con anticuerpos, apoya los resultados obtenidos con los inhibidores químicos y sugieren que la PDI de la superfi cie celular interacciona con el rotavirus durante el proceso de entrada a la célula, en una etapa posterior a la unión del virus a la célula.

La inhibición de la infección utilizando anticuerpos no descarta la actividad del tipo chaperona de la PDI sobre el rotavirus, porque al adicionar el anticuerpo anti-PDI se puede estar inactivando esta función; en cambio cuando se inhibe la infección con DTNB o la bacitracina se está alterando es la función de intercambio tiol-disulfuro de la PDI.

Cuando se bloquea la PDI celular con anticuerpos la inhibición es hasta un 90%; mientras que bacitracina y DTNB inhiben la infección en un 70-75%. Esta diferencia en la inhibición se podría explicar por que el anticuerpo y los reactivos inhiben funciones diferentes de la PDI.

Este comportamiento es diferente al observado en el modelo de difteria y VIH, donde el 100% de inhibición de la infección se alcanzó con el aumento de la concentración de DTNB, mientras que con los anticuerpos anti-PDI la inhibición fue menor (Mandel et al., 1993; Ryser et al., 1991; 1994).

Una interacción directa entre las partículas rotavirales y PDI fue evidenciada en un sistema libre de células, utilizando PDI soluble:

Analizada mediante western blot y ELISA. Esa interacción también fue analizada en un sistema celular en el cual se marcó con biotina la PDI exterior y se bloquearon las cisteínas internas de la célula con NEM, luego de adherido el virus RRV a la célula; se logró detectar la presencia de PDI marcada con biotina y al menos VP4 en la fracción enriquecida en membranas, correspondiente a los microdominios lípidicos rafts, implicando la conformación de complejos proteícos en los que se incluye PDI-rotavirus en el proceso de entrada.

Para determinar que dominios de las proteínas viales interactúan con PDI, se seleccionaron secuencias peptídicas con cisteínas, que en el caso de VP7, éstas son totalmente conservadas en las diferentes cepas rotavirales consultadas que incluyeron cepas humanas, de porcino, de bovino y de simio.

Los péptidos sintéticos de las regiones 200-219 de la proteína VP8, 189-210 y 243-264 de la proteína VP7 de la cepa RRV, están involucrados en el proceso de entrada del rotavirus a la célula ya que tanto los péptidos incubados con las células, como los anticuerpos dirigidos contra éstos inhiben la infección rotaviral.

Al incubar las células con los péptidos modificados (Cys por Ser), se requiere mayor concentración de estos últimos para alcanzar el 50% de inhibición de la infección rotaviral, indicando una posible disminución en la afi nidad, probablemente mediada por las proteínas de actividad disulfuro isomerasa de la superficie celular.

Los estudios publicados sobre la unión de PDI a péptidos indican interacciones tanto con el sitio catalítico redox como por su región “chaperona”:

Entre ellos, la interacción de PDI con la cadena polipeptídica de 28 residuos, aminoterminal de la nucleasa del staphylococus, y también la somatostatina (Klappa, et al 1997; Quan et al., 1995; Xiaou R 2005). En estos casos, la afi nidad de unión péptido-PDI aumenta cuando se incrementa la longitud del péptido, y para péptidos de igual longitud, aquellos que contienen cisteínas se unen 4 a 8 veces mas fuertemente a PDI (Morjana y Gilbert, 1991).

Los resultados obtenidos con los péptidos sintéticos de las proteínas VP4 y VP7 son compatibles con lo reportado por Klappa et al, (1997 y Morjana y Gilbert (1991). En nuestro caso, explica la menor afi nidad mostrada por el P9 sin cisteína, en el ensayo de inhibición de la infección rotaviral, en el cual para alcanzar el 50% de inhibición se necesitó hasta 0.90 mM de concentración del péptido.

En cambio, esta misma inhibición se alcanzó con 0.34 mM de concentración del péptido original con cisteína, P8 de VP4 (Fig. 8B). Igual comportamiento fue encontrado con las secuencias peptídicas de VP7, en las que los péptidos originales con cisteínas presentaron afinidades mayores a las obtenidas con los péptidos modificados con serina. En este caso, para el péptido P2 la afinidad fue 4.5 veces mayor que para el péptido P3.

Según estos resultados de afinidad:

Relacionados con las concentraciones inhibitorias al 50%, sugieren que la secuencia de VP7 243-264 presenta una mayor afinidad a la célula con 0.18 mM, le sigue la secuencia de VP4 200-219 con 0.34 mM, y luego la secuencia de VP7 189-210 con 1.09 mM.

Todos los péptidos modifi cados (cambio de Cys por Ser) presentaron mayor valor de concentración inhibitora al 50% al compararlas con el péptido original. Se han descrito proteínas que no son miembros de la familia PDI que muestran algún grado de actividad disulfuro isomerasa, algunas de ellas son las integrinas, la proteína espliceosomal humana y la fibronectina.

Las integrinas tienen 9 repeticiones CXXC en cada subunidad, en los dominios ricos en cisteínas; la actividad tiol-disulfuro ha sido medida en experimentos libres de células, en procesos de renaturación de enzimas como la Ribunucleasa A; ensayos de inhibición de la actividad se han obtenido al incubar estas proteínas con bacitracina (O’Neill et al., 2000; Reuter, K. 1999; Langenbach et al., 1999; Weston et al., 2001).

En este trabajo no se puede descartar la probabilidad de que el dominio 3, pueda también infl uir en este proceso redox en rotavirus ya que justamente, el péptido rotaviral CPN (161-169) de VP7 es el ligando de esta integrina en rotavirus. Sin embargo, el cambio de la Cys por Ser en este trabajo indicó que no afecta el porcentaje inhibitorio de la infección que ejerce el péptido CPN.

Se ha reportado que la proteína transmembranal TM-SU del virus de la leucemia murina está implicada en la actividad de fusión membranal:

Para cual exhibe actividad de isomerasa que actúa sobre sus propios enlaces tiol-disulfuro por poseer es proteína viral en su secuencia el motivo catalítico CXXC (Wallin et al., 2004), motivo que está ausente en el caso de las proteínas rotavirales.

No se ha determinado si el rotavirus utiliza todas las moléculas candidatas a receptores, hasta ahora publicadas, o solo alguna de ellas, dependiendo de la línea celular y de la cepa de rotavirus.

Probablemente algunos rotavirus inicialmente utilizan las fracciones de ácido siálico y otros glicoconjugados, por el dominio galectina de la proteína VP8 (Dormitzer et al., 2002).

Las interacciones secuenciales con las proteínas de la célula, probablemente dependen de qué receptores tiene la célula. Quizá diferentes cepas utilizan una o varias proteínas dependiendo de la disponibilidad en cada célula.

Quizá también utilicen diferentes dominios de las proteínas virales, para producir los cambios conformacionales que el virus necesita, uniéndose en diferente momento con la misma proteína celular. Así, otras regiones expuestas por las que continuaría la interaccion podría involucrar la parte carboxi Terminal de VP8 analizada en este trabajo, la región de 200 a 219, que podría ser de interacción con PDI.

Igualmente está las interacciones con diferentes integrinas:

Entre éstas, la integrina 12 con el motivo DGE de VP5 y los diferentes dominios de VP7 con las integrinas 14, v3, x2 y Hsc70 (Graham et al., 2003, 2005; Guerrero et al., 2000, 2002; Zárate et at., 2003, 2004; Coulson et al., 1997; López et al. 2006).

Una de las interacciones de pos-adherencia es la región carboxi-terminal de VP5 con Hsc70 en un paso que es posterior a la temprana permeabilización de la membrana celular; además de la que involucra a VP6 con Hsc70 (Pérez-Vargas et al., 2006; Gualtero et al 2007). En todos estos pasos PDI podría estar involucrada, dado que el virus necesita la actividad tiol-redox para tener los cambios conformacionales indispensables para la unión sucesiva con las proteínas de la célula, durante su internalización celular.

FIGURA 15. Mecanismo propuesto para la entrada de rotavirus, con adición de la participación de la PDI en un evento de post-unión pero antes de la internalización. Imagen modificada y adaptada de: López y Arias, 2004, y otras fuentes a saber: Graham et al., 2003, 2005; Superti et al., 1991; Isa, P et al., 1997; Rolsma, et al., 1998; Guo et al., 1999; Jolly et al 2000; Fiore et al 1991; Fuentes et al 1995; Dormitzer et al., 2002, Guerrero et al., 2000, 2002; Zarate et al., 2003, 2004; Coulson et al., 1997; Gualtero et at., 2007.

La incorporación de PDI al mecanismo propuesto de entrada del rotavirus se describe en la figura 15.

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