La marcación de los grupos tiol de las proteínas virales y de la superfi cie celular se realizó con Biotinyl-3-maleimidopropionamidyl-3-6-dioxaoctanediamine (EZ-link Maleimide PEO2-Biotin de Pierce).
A las monocapas de células MA104 preincubadas en presencia y ausencia de DTNB se les adicionó simultáneamente rotavirus purifi cado (TLPs de RRV) y 0.6 mM del reactivo EZ-link Maleimide PEO2-Biotin. El reactivo de biotina no reaccionante se trató con GSH (glutation reducido) (Markovic et al., 2003).
Alternativamente, el reactivo de biotina se adicionó a las TLPs, o también a monocapas celulares sin virus. Las células se lavaron y se lisaron con buffer de lisis (PBS pH 7.5, 0.1% SDS, 1.5% Triton X-100) en presencia de PMSF.
Una fracción de este lisado se analizó por ELISA, capturando con anti-rotavirus, o anti-PDI y reconociendo las proteínas capturadas con anti-PDI o anti-rotavirus respectivamente; la placa fue revelada con el sistema HRP-OPD.
Para detectar la incorporación de la biotina, otra fracción de las proteínas capturadas con anti-rotavirus o anti-PDI fueron analizadas con avidina-HRP (Pierce). (Lea también: Interferencia de la Infección por Rotavirus, Materiales y Métodos)
Péptidos sintéticos y anticuerpos anti-péptidos
Con base en un análisis de las secuencias de las proteínas rotavirales VP7 y VP4, las cuales contienen cisteínas, se seleccionaron péptidos con tamaños entre 19 y 22 residuos aminoacídicos, que fueron sintetizados en fase sólida por la estrategia F-moc.
Los péptidos se caracterizaron por espectrometría de masas Maldi-Tof y cromatografía HPLC. Se incluyeron secuencias control en las que se cambió la cisteína por serina, así como también el péptido con la secuencia de aminoácidos en desorden y secuencias no relacionadas con rotavirus que contienen o no contienen cisteínas (Tabla 1).
A los péptidos se les analizó su posible efecto tóxico sobre las células realizando un ensayo de viabilidad mediante azul de Tripán y MTT. Los péptidos, designados aquí como P2, P6, P8 y P17 (Tabla 1), fueron inoculados en conejos Nueva Zelanda con el esquema de inoculación 0, 20 y 40 días, a una concentración de 1 mg/ml, emulsifi cados en adyuvante completo de Freund (primera dosis) y con adyuvante incompleto de Freund (segunda y tercera dosis).
Se separó una alícuota de suero preinmune de cada conejo, al igual que el suero total después de la tercera dosis. Se determinó la especificidad estos sueros hacia los péptidos y hacia las partículas virales mediante ELISA. Tanto los péptidos como los anticuerpos se analizaron en ensayos de infectividad y de unión como se describió anteriormente.
Interacción PDI-TLPs y PDI-péptidos
PDI soluble (3 μg) purifi cada de hígado de bovino (Sigma) se adicionó a TLPs de RRV (1 μg), se incubó a temperatura ambiente por 30 minutos; la muestra se centrifugó a través de un colchón de sacarosa al 40% en PBS con 0.01% de BSA, por 50 minutos a 133.000 x g, con el objeto de precipitar el virus.
El precipitado se reconstituyó en PBS y la composición de proteínas fue determinada por “Western blotting”, utilizando anticuerpo anti-PDI y anti-rotavirus. La interacción de las proteínas también se analizó mediante ELISA de captura utilizando alternativamente anti-PDI-ratón o anti-rotavirus-cabra como anticuerpos de captura y detectando las proteínas del complejo con anti-rotavirus o anti-PDI, respectivamente.
El revelado se realizó con anti-conejo- HRP y el sistema OPD-peroxidasa (Pierce). Igualmente se realizó un ensayo de interacción PDI-péptidos, en una relación molar 1:4 en presencia y ausencia de DTNB, incluyendo un ensayo de competencia añadiendo diferentes concentraciones de péptido a la PDI soluble; después de 30 minutos de interacción, se adicionó el virus (1 μg de TLPs de RRV) y se incubó por otros 30 minutos; el complejo proteico se analizó mediante ELISA de captura.
TABLA 1. Secuencias de aminoácidos de péptidos rotavirales, modificados y no rotavirales
Interacción TLPs-PDI de la membrana celular
Para examinar la posible interacción PDI de la membrana celular con las proteínas del rotavirus, células MA104 y Caco-2 previamente marcadas con 5mM sulfo-NHS-SS-biotin, se incubaron con rotavirus RRV durante 30 minutos a 4ºC y 15 minutos a 20°C.
Después de este tiempo se adicionó 40mM de Netilmaleimido (NEM) por 30 minutos a temperatura ambiente para alquilar cualquier grupo tiol reactivo al interior de la célula. Las células se lavaron y lisaron en presencia Triton X100.
El producto de lisis se analizó mediante ELISA de captura, utilizando anti-PDI y antirotavirus alternativamente para capturar y detectar los antígenos. La posible interacción PDI superfi cial-TLPs se analizó por electroforesis y “Western blotting” de las proteínas biotiniladas previamente inmovilizadas con avidina-agarosa.
