Detección de Células Tumorales Circulantes Mediante Inmunomagnetismo

Principios básicos

El principio de las metástasis en el cáncer, consiste en la migración de las células malignas al sistema circulatorio y su localización posterior en órganos distantes. Así vemos como el cáncer de próstata metastatisa al tejido óseo, el cáncer de mama al pulmón o el cáncer colorrectal al tejido hepático, como primer lugar anatómico de localización (17).

1. La muestra

La muestra basal se recoge antes de comenzar cualquier régimen de quimioterapia. Las muestras posteriores se extraen en intervalos de 3 o 4 semanas, para seguir los niveles de CTC durante el tratamiento.

Si el paciente recibe doxorubicina, se debe esperar a que transcurran al menos 7 días desde la administración de una dosis antes de extraer la muestra. Esto es debido a que en las muestras enriquecidas con niveles tóxicos de doxorubicina se produce un marcaje alterado de leucocitos con citoqueratina y CD45 dualmente positivos, ya que este agente quimioterapéutico es un compuesto fluorescente que se incorpora en las células nucleadas.

La venopunción se realiza con técnicas asépticas y se extraen 10 ml de sangre total en CellSave® Preservative Tubes. El tubo de sangre periférica es procesado en Celltracks ®AutoPrep® System que nos proporciona una muestra enriquecida y lista para ser analizada en el Celltracks® Analyzer II (18,19).

2. La técnica

El principio básico de la técnica consiste en una selección por partículas inmunomagnéticas (ferrofluido) y tinción con reactivos inmunofluorescentes. El reactivo del ferrofluido consiste en nanopartículas con un núcleo magnético rodeado de una capa polimérica revestida con anticuerpos dirigidos al antígeno EpCAM para capturar las CTC. Tras la captura inmunomagnética y el enriquecimiento, se añaden los reactivos fluorescentes para la identificación y enumeración de las CTC. (Ver figura 1).

El conjunto de células seleccionadas con el ferrofluido se depositan en un cartucho que se introduce en un dispositivo de presentación celular MagNest® (Ver figura 2). El fuerte campo magnético del dispositivo MagNest®, atrae a las células epiteliales marcadas magnéticamente unidas al ferrofluido hacia la superficie del cartucho.

CellTracks Analyzer II® explora automáticamente toda la superficie del cartucho, adquiere las imágenes y muestra al operador cualquier evento donde CKPE y la fluorescencia DAPI aparecen en el mismo lugar. Las imágenes son presentadas al operador en un formato de galería para su clasificación final.

3. Interpretación de los resultados analizados en Celltracks® Analyzer II

El resultado nos indica el número de CTC en 7.5 ml de sangre periférica de la muestra extraída previamente. Esta interpretación solo es realizada por personal entrenado para ello, cada evento clasificado como célula tumoral debe tener un fenotipo: EpCAM positivo, CK positivo, DAPI positivo y CD45 negativo (Ver figura 3).

Los reactivos fluorescentes incluyen:

• Anti-CK-phycoerythrin (PE): específico para la proteína citoqueratina intracelular, esta marcación es una característica de las células epiteliales.

• DAPI: marcador que tiñe el núcleo de todas las células nucleadas. Por ello nos marca tanto los leucocitos, como las células epiteliales.

• Anti-CD45-Allophycocyanin (APC): específico para marcar los leucocitos.

Cáncer de mama metastásico: se considera que un recuento de CTC de 5 o más por 7.5 ml de sangre en cualquier fase de la enfermedad, se asocia a un peor pronóstico, es predictivo de una SLE y una SG más corta. (20).

Cáncer colorrectal metastásico: un recuento de CTC de 3 o más por 7.5 ml de sangre en cualquier fase de la enfermedad se asocia a un pronóstico malo, es predictivo de una SLE y una SG más corta. (20).

Cáncer de próstata metastásico: se considera que un recuento de CTC de 5 o más por 7.5 ml de sangre en cualquier fase de la enfermedad, se asocia a un pronóstico malo, es predictivo de una SLE y una SG más corta. (20).