Enfermedad de Morquio A: Diagnostico

DIAGNÓSTICO

El análisis de GAGs en orina fue el primer métododisponible para el diagnóstico de las MPS y en la actualidad es utilizado como prueba diagnóstica preliminar. Las pruebas cualitativas incluyen la precipitación de GAGs con albúmina ácida, bromuro de cetiltrimetilamonio o cloruro de cetilpiridinio, las cuales pueden ser utilizadas en métodos cuantitativos turbidimétricos cuando los valores son corregidos de acuerdo con la concentración de creatinina y la edad del paciente, reduciéndose el número de falsos negativos o positivos (43). Sin embargo, la cuantificación turbidimétrica con cloruro de cetilpiridinio presenta baja sensibilidad en muestras de pacientes con MPS IV A (44). Uno de los métodos más usados para la detección y cuantificación de GAGs en orina es la prueba colorimétrica con azul de dimetilmetileno, el cual presenta una sensibilidad cercana al 100%, una especificidad alrededor del 90% y la capacidad de permitir el diagnóstico de pacientes MPS I, III y IV, los cuales no son fácilmente diagnosticados por los otros métodos turbidimétricos (44, 45). Aunque la cuantificación turbidimétrica de GAGs en orina ofrece un tamizaje efectivo para muchas MPS, los niveles de GAGs en pacientes MPS IVA están próximos al rango de normalidad y disminuyen con la edad, dificultando el diagnóstico de estos pacientes (46). Esto hace que sea necesario el desarrollo de nuevos métodos de diagnostico más sensibles para MPS IVA. Los GAGs en orina pueden ser identificados cualitativamente por medio de separación electroforética en soluciones tampón de barbitona, acetato de bario, acetato cúprico o sulfato de zinc (43).

En general, el diagnóstico definitivo de las MPS se establece por determinación de la actividad enzimática. Para MPS IVA la actividad GALNS es determinada en leucocitos y fibroblastos empleandoel sustrato artificial fluorogénico 4-metilumbeliferil-ß-D-galactopiranósido-6-sulfato. La reacción requiere la acción secuencial de las enzimas GALNS y b-galactosidasa para la liberación del compuesto fluorogénico 4-metilumbeliferona (Figura 3). En pacientes MPS IV A con fenotipos severos la actividad GALNS en leucocitos es inferior al 5% de los valores encontrados en individuos no afectados, mientras que en fibroblastos la actividad se encuentra por debajo del 1% (47). En pacientes con fenotipos atenuados la actividad enzimática pueden variar desde 1,2% hasta 37% de los valores normales (48), y en heterocigotos está en un rango entre 40 y 70% (47). El diagnóstico prenatal puede ser realizado en líquido amniótico o vellosidades coriónicas (49). Recientemente se reportó la validación del método de cuantificación de actividad enzimática GALNS en muestras de sangre en papel de filtro (50). Aunque este método requiere un periodo de incubación mayor que el empleado con el método estándar, presenta una alta sensibilidad y especificidad permitiendo la identificación de pacientes MPS IVA.

Debido a que la MPS IV A es la única MPS en donde el metabolismo de QS se encuentra alterado, este GAG constituye un marcador potencial para el diagnóstico de la enfermedad. Tomatsu et al. (46), desarrollaron una prueba de ELISA empleando un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente QS, para su cuantificación en sangre y orina. Los resultados mostraron que la concentración de QS en pacientes MPS IV A e individuos no afectados varia en relación con la edad, mostrando un pico de entre los cinco y diez años de vida el cual disminuye lentamente hasta los 20 años, momento en el cual los valores se estabilizan. Sin embargo, los valores de QS en sangre son significativamente mayores en pacientes MPS IVA que en individuos no afectados. En orina el pico de excreción se logra durante los primeros 5 años de vida, disminuyendo lentamente hasta los 12-13 años y marcadamente a partir de este punto hasta estabilizarse después de los 20 años. Al igual que en sangre, los valores de QS en orina de pacientes MPS IVA se encuentran significativamente elevados, comparados con los valores de individuos no afectados.

Empleando el concepto de la cuantificación de GAGs en fluidos biológicos como método diagnóstico, se ha desarrollado un método basado en la determinación de disacáridos derivados del queratán, heparán y dermatán sulfato por cromatografía líquida de alta eficiencia acoplada a espectrometría de masas en tandem (LC-MS/MS) (51, 52). Con esta metodología se observó un aumento en los disacáridos derivados de QS en muestras de pacientes MPS IVA, comparado contra los valores obtenidos en individuos no afectados. Este método representa una herramienta importante para la implementación de pruebas de tamizaje neonatal en las MPS que permitan un diagnóstico sensible, así como el inicio de terapia a temprana edad (53).

La determinación de la actividad enzimática de GALNS se realiza con el sustrato artificial fluorogénico 4-metilumbeliferilb-D-galactopiranósido-6-sulfato, en un proceso que involucra la acción secuencial de GALNS y de la b-galactosidasa (B-Gal) para liberar el fluorógeno 4-metil-umbeliferona.

Otra estrategia desarrollada para el diagnósticode pacientes MPS IV A consiste en la cuantificación de la enzima GALNS en fibroblastos, plasma o sangre en papel de filtro empleando anticuerpos monoclonales específicos para la enzima (54). Basado en el hecho de que las mutaciones sobre el gen GALNS tienen un efecto directo sobre la estabilidad y plegamiento de la proteína, este método permite identificar pacientes MPS IVA con base en la disminución de la cantidad de enzima tanto en plasma como en muestras de papel de filtro (54). De forma similar, en el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo hemos desarrollado en huevos de gallina anticuerpos IgY policlonales epitope-específicos anti-GALNS (55), los cuales pueden podrían ser empleados para el desarrollo de estrategias diagnósticas similares.