Genética Molecular de la Hemofilia A, Materiales y Métodos

Muestra de Estudio

La investigación tuvo como muestra una familia colombiana de tres generaciones entre los 6 y 65 años con doble diagnóstico clínico (Figura 1), independientemente de su sexo, edad, posibles comorbilidades u otras características sociodemográficas.

Se excluyeron aquellos parientes que no presentaran vínculo consanguíneo. Según diagnóstico clínico de las diferentes Entidades Promotoras de Salud, la familia presentaba: un niño con Hemofilia A y Enfermedad de von Willebrand (Figura 1. Individuo III.1), (Anexo 2) una mujer que padece Enfermedad de von Willebrand (Figura 1. Individuo II.1) y una mujer portadora de Hemofilia A (Figura 1. Individuo II.2).

Los otros dos integrantes de la familia no habían sido diagnosticados clínicamente. Los miembros de la familia que participaron en el proyecto firmaron un consentimiento informado en el que autorizaron la toma de muestras de sangre y el uso de su material genético en este estudio.

El presente trabajo fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Los Andes, según Acta 211 de 2013. (Lea también: Genética Molecular de la Hemofilia A, Resultados)

Toma de Muestras

Se tomaron en tubos con EDTA dos muestras de sangre periférica a cada persona, por un profesional de la salud autorizado, una para el diagnóstico clínico y otra para el diagnóstico genético.

Diagnóstico Clínico de las dos Enfermedades

Para corroborar el diagnóstico clínico previo, se hizo un segundo diagnóstico clínico a los cinco miembros de la familia, esta vez no por cada Entidad Promotora de Salud, sino en un solo Laboratorio de Referencia en Hemostasia para garantizar que todas las pruebas se hicieran con las mismas técnicas y tuvieran los mismos valores de referencia.

Se solicitaron las mismas pruebas aprobadas por el Plan Obligatorio de Salud para estas coagulopatías: la actividad del FACTOR VIII (también llamada Antígeno plasmático del Factor VIII) y la actividad del Factor von Willebrand (también llamada actividad del coFactor ristocetina/del Factor von Willebrand FvW: RCo o FvW: Act) (17).

Extracción de ADN

Una vez recolectadas las muestras, se aislaron de ellas 350 µl de leucocitos y se hizo extracción de ADN por el método de salting-out (18) utilizando el kit de CorpoGen DNA2000. Se cuantificó la concentración de ADN mediante Nanodrop para la posterior amplificación.

Diagnóstico genético de Hemofilia A

Con el fin de abordar el problema de dos enfermedades en la familia se buscó descartar genéticamente la presencia de Hemofilia A y con ello reducir el doble diagnóstico a una sola condición posible, Enfermedad de von Willebrand.

El análisis molecular incluyó la detección de las dos mutaciones más frecuentes en casos de Hemofilia A: las inversiones 1 y 22. Por otra parte, se estableció el genotipo del gen del Factor VIII en cada individuo, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa.

Técnicas Moleculares para el Diagnóstico Genético de Hemofilia A

Inversiones de los intrones 1 y 22

La detección de las inversiones de los intrones 1 y 22 fue el primer paso en el filtro de mutaciones, pues en el caso de la inversión 22 se encuentra en el 40 a 50% de los pacientes con Hemofilia A severa (19).

Para detectarlas fue necesario usar una variación de la PCR, el análisis llamado LongDistance PCR, técnica basada en la Metodología de Liu et al. (20) y recientemente adaptada por Garcés-Gutiérrez (21).

Así, se realizó la reacción con mezclas de parejas de primers de acuerdo con lo reportado por Polakova et al. (22).

En la mezcla de PCR se usó el kit Platinum ® PCR SuperMix High Fidelity (Invitrogen) con los siguientes componentes ya incorporados: Taq DNA polimerasa, polimerasa termoestable de la especie Pyrococcus GB-D, Anticuerpo Platinum ® Taq; 66 mM Tris-SO4 (pH 8.9); 19.8 mM (NH4 ) SO4; 2.4 mM MgSO4 ; 220 µM dNTPs y estabilizadores.

Las condiciones de temperatura para la LD-PCR fueron: una denaturación inicial de 94°C por 2 minutos, seguida de 40 ciclos de denaturación a 94°C por 30 seg, alineamiento a 55°C por 30 seg y una extensión a 68°C por 13 min en cada ciclo. Los productos obtenidos se corrieron en un gel al 0,6% de agarosa a 80V por 3 horas.

Para la detección de la inversión del intrón 1 se usó el protocolo descrito por Bagnall et al. (23). Se usó la mezcla de primers 9cR, 9F e int1h-2F en la detección de la región int1h-1 y la mezcla int1h-2F, int1h-2R y 9F para la detección de la región int1h-2 y se compararon sus productos de amplificación (Anexo 4).

Para la mezcla de reacción se utilizó del mismo modo el kit Platinum ® PCR SuperMix High Fidelity (Invitrogen), pero en una PCR-multiplex en donde se colocaron al tiempo los cuatro primers antes mencionados (Anexo 3).

Las condiciones de temperatura de la PCRmultiplex para la inversión 1 contemplaron una denaturación inicial a 94°C por 30 segundos, seguida de 30 ciclos compuestos de una denaturación a 94°C por 30 segundos, alineamiento a 55°C por 30 segundos y una extensión a 68°C por 2 minutos.

Posteriormente, la observación y análisis de los productos esperados se realizó en un gel de agarosa al 1% y se corrió a 70V por 40 minutos.

Secuenciación del Gen del Factor VIII

La secuenciación se realizó amplificando los 26 exones con ayuda de los primers ya reportados en la base de datos https://hadb.org.uk/WebPages/ Database/Methods/keeneyprimers.doc. (Anexo 5) y bajo las siguientes condiciones de PCR: 95ºC por 2 minutos, seguido de 30 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 59ºC por 45 segundos y 72ºC por 90 segundos.

La extensión final fue de 72ºC por 5 minutos. Finalmente, se realizó una electroforesis para evaluar los tamaños esperados para cada exón en un gel al 2% de agarosa a 70V por 40 minutos. Posteriormente, se secuenciaron los productos de la PCR por el método de Sanger.

Los resultados observados en los 26 exones del gen de la familia estudiada fueron confirmados tres veces. Se repitieron las secuenciaciones con el Fordward y el Reverse.

Análisis de Resultados

A través de la electroforesis y la posterior secuenciación, se observaron los fragmentos esperados para cada exón del Factor VIII. Con ayuda del programa CLC Main Workbench 7 se alinearon las secuencias de cada individuo con la secuencia consenso proporcionada por NCBI (24).

Para conocer el posible efecto de dichas variaciones se utilizaron tres software, SIFT, PROVEAN y SNPeffector, que permitieron predecir si la sustitución de un aminoácido o un indel tiene algún impacto en la función biológica de la proteína del Factor VIII (25).