Área de Ciencias Básicas y Experimentales Determinación de la Función de la Proteína

En Caco-2 la inhibición fue del 80% para Wa, 66% para RRV y 68% en YM (Fig 1B). En las células MA104 el péptido IV de VP6 inhibió la infección de las tres cepas de manera dosis dependiente. En MA104 la inhibición fue alrededor del 94 % para RRV y YM y del 74 % en Wa (Fig 1C). En Caco-2 del 91 % para Wa, 83 % para RRV y 90% en YM (Fig 1D). En las dos líneas celulares los péptidos control no tuvieron ningún efecto en la infección con las tres cepas de rotavirus y en todos los experimentos cada virus utilizado se incubó con los diferentes péptidos control.

Efecto del péptido VP4 y VP6

Efecto del péptido VP4 y VP6

FIGURA 1. Efecto del péptido VP4 y VP6 sobre la infectividad de Wa, RRV y YM. Las células confluentes en placas de 96 pozos fueron incubadas durante una hora a 37 º C con diferentes concentraciones de los péptidos. A y B, Péptido II de VP4 y los péptidos control II, VI y VII con concentraciones desde 0.125 hasta 4 mg/ml. C y D, péptido IV de VP6 y los péptidos control V, VI y VII con concentraciones desde 0.015 hasta 2 mg/ml. Posteriormente las células fueron infectadas con 1000 UFF del correspondiente virus por 1 hora a 37ºC. El exceso de virus fue removido y la infección continuó 14 horas a 37ºC. Las células fueron fijadas y teñidas por inmunocitoquímica. Los resultados son expresados como % de infectividad con respecto a células tratadas con MEM. La curva representa los resultados de al menos tres experimentos independientes cada uno por duplicado.

Como control experimental, se determinó que los péptidos sintéticos no tienen efecto en el ciclo de replicación viral, dado que al infectar primero las células con el virus y luego incubarlas con las diferentes concentraciones de los péptidos no hubo diferencias, respecto a las células incubadas solamente con MEM (datos no mostrados). Estos resultados permiten sugerir que los péptidos compiten con los viriones por moléculas receptoras inhibiendo de esta manera la entrada del rotavirus.

Las DLPs inhiben la infección de rotavirus en células MA104 y Caco-2. Puesto que el péptido sintético de VP6 (280-297) inhibe la infección de los rotavirus quisimos determinar si VP6, que conforma las partículas de doble capa (DLPs), no infecciosas, era capaz de inhibir la infección durante el proceso de entrada del rotavirus.

Para esto, células confluentes MA104 y Caco-2 fueron incubadas con diferentes concentraciones de DLPs de RRV, purificadas por gradiente de CsCl y posteriormente se desafiaron con cada uno de los rotavirus (Fig. 2). En células MA104 las DLPs inhibieron la infección de Wa, RRV y YM de manera dosis dependiente, alcanzando una inhibición alrededor del 81 % para las cepas RRV y YM y de 61% para Wa, cuando todos los ensayos fueron conducidos a una concentración de 3.8 (g/ml de DLPs (Fig. 2A).

células Caco-2

Igualmente, en células Caco-2 las DLPs inhibieron la infección de Wa, RRV y YM de manera dosis dependiente, alcanzando una inhibición de alrededor del 87 % para las cepas RRV y YM cuando los ensayos fueron realizados a una concentración de 3.8 (g/ml de DLPs (Fig. 2B). Para la cepa Wa se alcanzó una inhibición de 83 % a una concentración de 120 ng/ml de DLPs (Fig. 2C). De esta manera, Wa requiere 30 veces menos concentración de DLPs para alcanzar el mismo porcentaje de inhibición respecto a RRV y YM en células Caco-2, mientras que en células MA104 no se observó esta diferencia en la sensibilidad a la inhibición. El resultado fue similar si las células se lavaban o no luego de incubarlas con DLPs y desafiarlas con los rotavirus.

Efecto de las DLPs

FIGURA 2. Efecto de las DLPs en la infectividad de Wa, RRV y YM en células MA104 (A) y Caco-2. (B y C) células confluentes en placas de 96 pozos fueron incubadas a 37º C por 45 minutos con diferentes concentraciones de DLPs entre 0.01 hasta 3.8 mg/ml o péptido control V (0.5 mg/ml). Posteriormente se infectaron con 1000 UFF del correspondiente virus por 1 hora a 37ºC. El exceso de virus fue removido y la infección continuo 14 horas a 37º C. Finalmente las células fueron fijadas y teñidas por inmunocitoquimica como se describe en materiales y métodos. Los resultados son expresados como % de infectividad con respecto a células tratadas con MEM. La curva representa los resultados de al menos tres experimentos independientes por duplicado.

Dado que los resultados de inhibición de la infección producidos por la incubación previa de las células con DLPs no excluyen que la inhibición sea una consecuencia de un impedimento estérico asociado a la unión inespecífica y masiva de las DLPs, se realizó un ensayo de infección en células MA104, en el cual se incubaron las células primero con DLPs en cantidades decrecientes y luego se llevó a cabo un desafío con TLPs en una cantidad constante y correspondiente a la utilizada para obtener un grado de infección de referencia asumido como el 0% de inhibición. De esta manera, se obtuvieron relaciones molares entre las TLPs y las DLPs.

Para hallar estas relaciones molares, primero se calculó la concentración de TLPs que generaba entre 4-5 X 106 UFF/ml. Las partículas virales TLPs y DLPs fueron cuantificadas por espectrofotometría a 260 nm teniendo en cuenta un coeficiente de extinción propio para nucleoproteínas con un contenido definido de RNA y se determinó mediante cálculo teórico que para la preparación utilizada los 4-5 X 106 UFF/ml correspondían a 2.1×109 partículas/ml de TLPs.

Igualmente se realizaron los cálculos para determinar el número de partículas de DLPs. De esta manerase realizó un ensayo de infección teniendo en cuenta la relación molar TLPs/DLPs (Fig 3). El resultado mostró que las DLPs bloquearon la infección de las TLPs en un 98%, 62 % y 13% a una relación molar TLP/ DLP de 0.25, 8 y 16, respectivamente.

Inhibición de la infección de TLPs

FIGURA 3. Inhibición de la infección de TLPs a diferentes soluciones molares de TLP/DLP. Células MA104 en cajas de 96 pozos fueron incubadas con DLPs desde 0.78mg/ml (relación 0.25) posteriormente fueron infectadas con 0.32 mg/ml de TLPs previamente activadas con tripsina. Los datos son presentados como % de infección. Como control se utilizo TLPs tratados con anticuerpo neutralizante (27, 36) y células tratadas con MEM. La relación molar se obtiene de dividir el número de partículas teóricamente calculadas de TLPs sobre las DLPs (tabla).

Estos resultados apoyan que el efecto inhibidor en la infección de las cepas Wa, RRV y YM con las DLPs no es debido a un impedimento estérico por moléculas receptoras que utilizan las DLPs, y que de alguna manera interfieren muy probablemente con la unión de las TLPs.

La suma de péptidos sintéticos o de péptido y DLPs inhibe la infección de rotavirus en células MA104 y Caco-2. Quisimos determinar si los péptidos se están uniendo a una misma molécula receptora o a diferentes receptores. Para esto, utilizamos la concentración media inhibitoria de cada péptido para que teóricamente permaneciera libre la mitad de las moléculas receptoras de la superficie de la célula. Si se unen a una misma molécula receptora la adición de los dos péptidos, o un péptido y DLPs, saturaría nuevamente todos los sitios de unión posibles del mismo receptor restaurando el valor máximo. Si se une a diferentes receptores no debería presentarse efecto aditivo.

En este experimento se utilizó la concentración de inhibición media-máxima de cada péptido y de las DLPs. Células MA104 confluentes fueron incubadas con 1mg/ ml del péptido II más 0.25 mg/ml del péptido IV y posteriormente infectadas con rotavirus. La suma de los péptidos II y IV a concentraciones de inhibición media-máxima tuvo un efecto inhibidor aditivo del 75 % para la cepa Wa y del 83 % para la cepa RRV. Para la cepa YM no se encontró efecto inhibidor aditivo al utilizar la suma de los péptidos, presentándose una inhibición de sólo 28% (datos no mostrados).

En células Caco-2, la suma de los péptidos tuvo un efecto inhibidor aditivo del 83 % para las cepa Wa, del 82 % para RRV y del 73 % para la cepa YM (datos no mostrados). Estos resultados muestran que la suma de péptidos aconcentraciones de inhibición media-máxima para las tres cepas de rotavirus en Caco-2 y en MA104 tiene un efecto aditivo, alcanzando porcentajes de inhibición similares a los obtenidos con las concentraciones máximas de cada uno de los péptidos individuales, excepto para la suma de los péptidos VP6 y VP4 en las células MA104 frente a la infección con la cepa YM.

Las células tratadas con péptido control III más el péptido IV confirman que la concentración de inhibición media máxima de los péptidos II y IV permiten la infección con valores cercanos al 50 % de la inhibición que presentaron las tres cepas de rotavirus utilizadas. Igualmente, células MA104 y Caco-2 fueron incubadas con el péptido II más DLPs o péptido IV más DLPs a concentraciones de inhibición media-máxima y posteriormente infectadas con rotavirus Wa, RRV y YM. La suma de DLPs más el péptido II bloqueó la infección de las cepas Wa, RRV y YM en porcentajes del 81%, 82% y 72%, respectivamente, en células MA104 y del 82%, 78% y 76% para Wa, RRV y YM, respectivamente, en células Caco-2. Similar a lo observado en el ensayo de suma de peptidos, la cepa Wa fue más sensible al bloqueo en la infección en Caco-2 que las cepas RRV y YM.

La suma de DLP más el péptido IV bloqueó la infección en un 79% para las cepa Wa, y alrededor de 84% para las cepas RRV y YM en células MA104 (datos no mostrados. En células Caco-2 se alcanzó un bloqueo de la infección máxima del 91% para Wa, 81% para RRV y del 79% para YM (datos no mostrados).En los cultivos celulares control donde se trató con DLPs más péptido control, se alcanzó aproximadamente un 50% de la inhibición que presentaron todas las cepas virales y en las dos líneas celulares ensayadas.

Al adicionar solamente el péptido control no se presentó efecto inhibidor. Los resultados en las dos líneas celulares utilizadas muestran que la combinación a concentraciones de inhibición media-máxima de partículas DLPs y de los péptidos VP4 y VP6, tiene un efecto aditivo, el cual alcanza porcentajes de inhibición de la infección similares a los obtenidos con la aplicación individual de estos inhibidores a concentraciones máximas.

Los rotavirus utilizan los dominios 531-554 de VP4 y 280-297 de VP6 durante el proceso de entrada a la célula. Los péptidos sintéticos II y IV que contienen secuencias de VP4 y VP6, respectivamente, tienen un efecto inhibidor sobre la infección por rotavirus, esto sugiere que los rotavirus utilizan tales dominios durante el proceso de entrada a la célula.

Para explorar esta posibilidad se utilizó suero hiperinmune generado contra estos péptidos sintéticos de la región 531-554 de VP4 y 280-297 de VP6 para determinar si los anticuerpos bloqueaban la infección. Células MA104 confluentes fueron incubadas con TLPs de la cepa Wa a 4ºC y luego incubadas con diferentes diluciones de suero hiper-inmune que reconoce los péptidos II de VP4 y IV de VP6. Como control se utilizó TLPs incubadas con suero pre-inmune (Fig 4).

Anticuerpos contra los péptidos VP4 y VP6

FIGURA 4. Anticuerpos contra los péptidos VP4 y VP6 inhiben la infección de rotavirus. Células MA104 en placas de 96 pozos fueron incubadas a 4 ºC por 30 minutos con TLPs (0.32 mg/ml) previamente activados con tripsina. A la misma temperatura se adicionó suero hiper-inmune contra los péptidos VP4 o VP6 o sus pre-inmunes durante 30 minutos. Luego las células se incubaron a 37 ºC por 1 hora, se lavaron y se incubaron 12 horas a 37 ºC. Las células fueron fijadas y teñidas por inmunocitoquimica como se describe en materiales y métodos. Los resultados son expresados como % de infectividad con respecto a células tratadas con MEM. La curva representa los resultados de al menos tres experimentos independientes cada uno por duplicado. Los resultados fueron reproducibles con los dos anticuerpos generados contra cada uno de los péptidos.

Los sueros hiper-inmunes contra los péptidos VP4 y VP6 bloquearon la infección de las TLPs alrededor del 45% y 57%, respectivamente. Como control experimental, se determinó que los anticuerpos no tienen efecto en las células dado que al infectar primero las células con el virus y luego incubarlas con los anticuerpos (pre e hiper inmunes) no hubo diferencias, respecto a las células incubadas solamente con MEM.

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