Área de Ciencias Básicas y Experimentales Determinación de la Función de la Proteína

Vp6 y los Péptidos (280-297) de Vp6 (530-559) de Vp4 en la Entrada de Rotavirus

Guerrero Carlos A1*, Gualtero Diego F.1, Guzmán Fanny1, Rodríguez Luz S.1, Acosta L. Orlando1.

Resumen

El mecanismo de entrada de los rotavirus es un proceso de múltiples pasos el cual no está completamente entendido. La proteína de choque térmico HSC70 (heat shock cognate 70) ha sido propuesta como molécula co-receptora para la entrada de rotavirus. Mediante inmunoprecipitación identificamos la interacción de las proteínas VP6 y VP4 de la cápside del rotavirus RRV con HSC70 en lisados de células MA104 previamente infectadas con rotavirus, sugiriendo la interacción de HSC70 con más de una proteína viral. Posteriormente se dedujeron las secuencias 531-554 de VP4 y 280-297 de VP6 en base a secuencias reconocidas que unen a HSC70.

En este estudio determinamos que DLPs y los péptidos sintéticos (280-297) de VP6 y (531-554) de VP4, deducidos teóricamente como de unión a HSC70, inhibían la entrada de los rotavirus RRV, YM y WA de manera dosis dependiente en células MA104 y Caco-2. Igualmente la adición de los péptidos VP4 y VP6 o de DLPs más los péptidos, a concentraciones de inhibición media máxima, inhibió la infección de las tres cepas de manera aditiva. Sueros hiper-inmunes contra los péptidos bloquearon la infección de partículas infecciosas TLPs.

Además mediante un ensayo in vitro se determinó la interacción de DLPs con HSC70. Estos resultados sugieren que VP6 participa durante el proceso de entrada de rotavirus uniéndose a HSC70.

En resumen, este y otros trabajos confirman la función de la proteína HSC70 como molécula receptora durante la entrada de los rotavirus. Probablemente los dominios 280-297 de VP6 y 531-554 de VP4 son regiones utilizadas por los rotavirus para unirse a HSC70, lo cual apoya el modelo de entrada de múltiples pasos involucrando cambios conformacionales en la partícula viral.

Palabras claves: rotavirus, infección, heat shock cognate HSC70, partículas con doble capa (DLPs), péptidos sintéticos.

Introducción

Los rotavirus son el principal agente etiológico de diarreas en niños menores de cinco años a nivel mundial. Estos virus ocasionan cada año 352000 a 592000 muertes (32). In vivo afecta fundamentalmente el intestino delgado e in vitro infectan líneas celulares epiteliales de origen renal como MA104 e intestinales como Caco-2.

Los rotavirus pertenecen a la familia Reoviridae. Son virus de simetría icosahédrica que carecen de membrana lipídica y se caracterizan por tener tres capas concéntricas de proteína que envuelven un genoma de 11 segmentos de RNA de doble cadena (dsRNA). La cubierta externa está formada por la glicoproteína VP7, y por la hemaglutinina VP4; ésta última se proyecta de la superficie del virus como espigas de 10-12 nm. La capa intermedia está formada por VP6, siendo ésta la proteína más abundante en el virión, representando aproximadamente el 51% de la masa viral. La pared de la nucleocápside o ¨core¨ está constituida por la proteína VP2, que engloban al genoma viral (14). Para que el virus sea infeccioso requiere el clivaje de VP4 por tripsina originando las subunidades VP8 y VP5.

Para que se lleve a cabo la infección de la célula por el rotavirus son necesarias interacciones moleculares entre la célula hospedera y el virus. Este proceso complejo probablemente ocurre por interacciones secuenciales de las proteínas de la superficie de los virus VP4 y VP7 con al menos moléculas de superficie celular diferentes, dispuestas en microdominios lipídicos «rafts» (1,18,20,24,36).

Entre estas moléculas de superficie celular involucradas en la infección por rotavirus está la proteína de choque térmico HSC70 ha sido propuesta como molécula co-receptora en la entrada del rotavirus, al bloquear la entrada del rotavirus preincubando las células con anticuerpos contra HSC70 o proteína recombinante humana HSC70 (19).Utilizando péptidos sintéticos de proteínas virales se han sugerido dominios de estas proteínas como sitios de reconocimiento para HSC70 e integrinas (11, 38, 39,40). Estudios dirigidos al desarrollo de vacunas han encontrado elevada protección al utilizar a VP6 como inmunógeno mediante diferentes estrategias (5,7,8,9,10,16,27, 31,34).

Materiales y Métodos

Células y virus. La línea celular de riñón de mono verde africano, MA104, se cultivó en MEM (Eagle´s Minimal Essential Médium), suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino (SFB). La línea celular de cáncer de colon Caco-2, se cultivó en DMEM suplementado con 20% de SFB.

Coinmunoprecipitación. Para la inmunoprecipitación de HSC70 con proteínas rotavirales se tomaron alícuotas de lisados de células infectadas con rotavirus (1000 UFF), después de 24 a 48 horas postinfección y se precipitaron mediante ultracentrifugación.

El precipitado se resuspendió en MEM y cada alícuota de 100µl contenía 30µg de proteína que se incubó con 10µl de anticuerpo policlonal de conejo anti-HSC70, (generado mediante HSC70 recombinante humana), utilizando como control de la inmunoprecipitación un anticuerpo no relevante, en este caso, un anticuerpo policlonal de conejo (ab-1) dirigido contra la oncoproteína c-neu (oncogene research). Las alícuotas se incubaron con el respectivo anticuerpo a 4(C toda la noche y se precipitó con proteína A-sepharosa (50 % p/v) manteniendo en agitación suave por 30 minutos.

El precipitado se lavó tres veces con buffer RIPA (50mM tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40 (NP-40(, 0.5% deoxicolato de sodio, 0.1% dodecilsulfato de sodio (SDS), con 1mM de fenilmetilsulfonilfloruro (PMSF(), luego se hizo un lavado con buffer 50mM HEPES (N-2hidroxietilpiperazina-N´-ácido etanosulfónico) pH: 7.0, 1% NP-40. Posteriormente se hizo un lavado con NaCl 2M, dos con buffer RIPA y dos con agua destilada.

A cada precipitado se le adicionó 25µL de buffer de muestra de Laemmli 1X y se hirvieron durante 3 minutos. Luego, las muestras fueron separadas por SDS-PAGE y se realizó un «Western Blot» húmedo (mini trans-blot cell de Biorad). Las membranas se bloquearon una hora con leche descremada en PBS solución 5% (p/v). Luego se incubaron con anticuerpo primario hecho en conejo contra rotavirus, o anticuerpo monoclonal de ratón antiVP6, 1026 (31) (donado por el Laboratorio de Genética Humana de la Pontificia Universidad Javeriana) durante toda la noche.

Luego se lavó la membrana y se incubó con anticuerpo secundario conjugado con biotina y se reveló utilizando el sistema ABC (avidina-biotina-peroxidasa y luminol super signal west dura extended de PIERCE).

Purificación de partículas virales. El lisado viral de células MA104 de la cepa Wa con aproximadamente 106 UFF/ml a 107 UFF/ml (unidades formadoras de focos UFF) se ultracentrifugó a 101500 X g por 1 hora 30 minutos a 4ºC. El pellet fue resuspendido en 1 ml de buffer TSM (Tris 0.01 M, pH 7.4, NaCl 0.15 M, MgCl2 0.001M, CaCl2 1 M). Luego se adicionó Freón (1,1,2 Triclortrifluoretano) para disociar membranas (1:1/3 vol:vol virus:Freón) y se dio vortex por 5 minutos. Se recolectó el sobrenadante y se repitió el procedimiento tres veces, adicionando nuevo buffer cada vez.

El sobrenadante total recolectado fue ultra centrifugado a 101 500 X g por 1 hora 30 minutos a 4ºC para sedimentar el virus. El sedimento fue resuspendido en TSM y ultra centrifugado a 217 100 X g (rotor Sorvall TST 60.4) por 1 hora a 4ºC en un gradiente de cloruro de cesio (CsCl): 0.5 ml con densidad 1.4157, 1 ml con densidad 1.3039, 0.5 ml con densidad 1.2070 y 0.5 ml con sacarosa 30%.

La banda de TLPs y DLPs fue resuspendida cada una en buffer TSM. La fracción correspondiente a las DLPs, se centrifugó a 101 500 X g por una hora a 4ºC. El pellet fue resuspendido en buffer TSM (sin CaCl2 ni MgCl2) con EDTA 50 mM y se dejó durante 1 hora a 37ºC. Nuevamente se centrifugó a 101 500 X g por una hora a 4ºC para retirar el EDTA y se resuspendió en TSM (sin MgCl2 y CaCl2).

Las partículas virales TLPs y DLPs fueron cuantificadas por espectrofotometría a 260 nm teniendo en cuenta el coeficiente de extinción para este tipo de núcleo partículas y se determinó la concentración de partículas virales teniendo en cuenta la siguiente fórmula:

O.D = K x C (O.D = Densidad óptica, C = concentración mg/ml, K = coeficiente de extinción: 8 para DLP y 6 para TLP).

Péptidos. Secuencias peptídicas de VP4 (531-554) y VP6 (280-297) fueron sintetizadas químicamente por la metodología en fase sólida, purificadas por HPLC, caracterizadas por espectrometría de masas y luego liofilizadas. Como control se sintetizaron péptidos no relacionados y péptidos con el mismo tipo y número de aminoácidos pero con secuencia aleatoria (Tabla 1). Los péptidos fueron resuspendidos en medio MEM, pH 7 y se utilizaron en los ensayos de infectividad.

Ensayos de toxicidad celular. A cada uno de los péptidos se les hizo prueba de toxicidad en células MA104, mediante la técnica de azul de Tripan y MTT como ha sido previamente reportado (30).

Ensayo de infectividad. Inicialmente se hicieron curvas de infección, para hallar la concentración máxima y mínima probable de los péptidos y DLPs con actividad de inhibición de la infección, para esto se tuvo en cuenta trabajos con metodología similar ya reportada (107,106, 19). Las placas de 96 pozos confluentes con células MA104 o Caco-2 fueron tratadas con diferentes concentraciones del péptido VP4 (0.125 – 4 mg/ml), VP6 (0.015- 2 mg/ml) o DLPs (0.01- 4µg/ ml) por 1 h a 37 °C y 5% de CO2.

En cada placa el tratamiento se hizo por duplicado, en pozos a los cuales se les añadió un volumen total de 30µl. Luego se adicionó una preparación viral que tenía un título de unidades formadoras de foco (UFF) de 106/ ml a 107/ml de un lisado viral, previamente activado con tripsina, de las diferentes cepas de rotavirus (Wa, RRV y YM) para cada uno de los tratamiento y se incubó 1 hora a 37º C en MA104 y Caco-2.

Las placas fueron lavadas dos veces con MEM e incubadas 12 horas a 37°C y 5% de CO2. Posteriormente, las células fueron fijadas con metanol puro, frió, por 45 minutos a 4°C. Las células fueron lavadas tres veces con PBS e incubadas con un anticuerpo policlonal contra rotavirus generado en conejo a partir de virus purificado por CsCl.

Posteriormente, el Ac primario se incubó con un conjugado – HRP (SC 2004, Santa Cruz, Dilución 1:3000 en PBS) por 1 hora a 37°C. En cada paso las células se lavaron dos veces con PBS. Las placas se revelaron con AEC (3-amino-9-ethyl carbazole, SIGMA) y se contaron las UFF en un microscopio invertido (Euromex, Holanda). Se utilizaron tres controles: el péptido de VP6 o de VP4 con la secuencia aleatoria, un péptido no relacionado y MEM. En todos los experimentos cada virus utilizado se incubó con los diferentes péptidos control.

El porcentaje de infección en todos los casos se relacionó tomando como el 100% los focos contados en los pozos que solamente se realizo la infección en medio MEM.

Producción de Anticuerpos policlonales contra los péptidos sintéticos de VP4 y VP6. Conejos Nueva Zelanda de 3 meses de edad fueron sangrados para obtener suero preinmune. Estos mismos conejos posteriormente fueron inoculados subcutáneamente con 0.5 mg del péptido de VP4 o de VP6 más 0.5 mg del péptido FIS (FISEAIIHVLHSR) junto con adyuvante completo de Freund en la primera inoculación. La segunda y tercera inoculación se aplicó con adyuvante incompleto de Freund cada 20 días.

Finalizado el esquema de inoculación el conejo se llevó a blanco. La sangre se dejó 30 minutos a 37°C y 12 horas a 4°C, posteriormente se centrífugo a 10.000 X g (Beckman) a 4°C durante 30 minutos para recuperar el suero que se mezcló con glicerol (1:1 vol:vol) y azida al 0.02% y se almacenó a -20 °C hasta su uso. Para cada péptido se inocularon dos conejos, generando dos anticuerpos.

Bloqueo de la infección con Anticuerpos contra los péptidos sintéticos. TLPs de la cepa Wa con aproximadamente 106 UFF/ml a 107 UFF/ml, purificadas en gradiente de CsCl, activados previamente, fueron adheridos a células MA104 confluentes a 4ºC durante 45 minutos. La placa de 96 pozos fue lavada dos veces con MEM e incubada con diferentes diluciones de suero hiper-inmune contra los péptidos VP4 y VP6 a 4ºC durante 30 minutos, luego las células fueron incubadas a 37ºC durante 45 minutos, en una atmósfera de 5% de CO2. Las células se lavaron 2 veces con MEM y se incubaron 12 horas a 37ºC, a una atmósfera de 5% de CO2.

Las células se fijaron y revelaron como se describió anteriormente para el ensayo de infección. Como control se utilizó suero pre-inmune de los mismos conejos y los resultados fueron graficados como porcentaje de infección con respecto al titulo del anticuerpo.

ELISA. Como anticuerpo de captura se usó suero policlonal contra rotavirus hecho en conejo (1:500) y el de detección del antígeno un anticuerpo policlonal contra HSC70 hecho en cabra (0.4 (g/ml, Santa Cruz Biotechnology INC). Se mezclaron diferentes concentraciones de HSC70 recombinante (0.074 – 1.4 mg/ml) (obtenida del laboratorio del Dr Carlos F Arias del Instituto de Biotecnología de Cuernavaca, UNAM, México) con DLPs (1µg/ml), se incubaron toda la noche a 4 (C en agitación y la mezcla se adicionó sobre el anticuerpo de captura en la placa de ELISA (Nunc) previamente bloqueada con leche descremada al 3% y ovoalbúmina al 2%. El antígeno con el anticuerpo de captura se incubó toda la noche. Luego se hicieron tres lavados con buffer PBS-Tween 20 (0.05%).

Se adicionó el anticuerpo contra HSC70 en solución de bloqueo PBS-T y se incubó durante una hora a 37ºC. Luego de lavar tres veces la placa se incubó con anti-cabra HRP (1:5000) durante una hora a 37ºC. La placa se reveló utilizando como sustrato OPD (O- Fenilenediamina dihidrocloruro, PIERCE) diluido en buffer para peroxidasa. Las placas fueron leídas como absorbancia a 493 nm en un lector de ELISA. Como control negativo se utilizaron pozos sin HSC70 recombinante.

Análisis de datos. Todos los datos fueron expresados como media y desviación estándar para tres experimentos independientes en los cuales los grupos fueron probados por duplicado en cada uno de los ensayos.

Resultados

HSC70 se asocia con VP4 y VP6. Mediante la técnica de imunoprecipitación se encontró que la proteína HSC70 coinmunoprecipita la proteína viral VP6 identificada mediante un anticuerpo monoclonal (1026). VP4 y VP6 presentan secuencias de unión a HSC70. Dado que HSC70 interacciona durante la infección con VP4 y VP6 nos propusimos determinar si existían dominios probables de unión de las proteínas virales a HSC70. Para esto, primero se identificaron 40 péptidos reportados en la literatura (2,37) como de unión a HSC70 y su secuencia se alineó con la secuencia de las proteínas virales VP6 y VP4. La alineación de diferentes rotavirus, humanos y de animales, se hizo mediante el programa Clustal X www.evolution.genetics/philyp/.

Realizada la alineación, se seleccionaron secuencias que presentaron características:

1. Alta homología con las proteínas virales.
2. Sobrelapamiento en la misma secuencia viral con más de uno de los 40 péptidos.
3. Conservación de región elegida en los diferentes tipos de rotavirus
4. Exposición de la secuencia en el virión, con respecto a las demás proteínas. Con estos criterios se seleccionó la región (531-554) FSGIKSTIDAAKSMA TNVMKKFKK de VP4, y la región (280-297) IVARNFD TIRLSFQLRPP de VP6 (Tabla 1). Debido a que la secuencia del péptido de VP4 contenía el tripéptido IDA (Ile-Asp-Ala), reportado como de unión a integrina α4β1, la cual ha sido reportada como receptor para la cepa SA11 de rotavirus (22), se sintetizó el péptido II (531-554) de VP4 al cual se le cambio el tripéptido IDA por LEG (Leu-Glu-Gli) que son aminoácidos que pertenecen al mismo grupo funcional. Como péptidos control se sintetizaron péptidos con el mismo tipo y número de aminoácidos, pero con secuencia aleatoria.

Igualmente se sintetizaron péptidos control de secuencia no relacionada. El ensayo de viabilidad con azul de Tripan y MTT mostró que el péptido VP4 (I) tenía un efecto citotóxico en las dos concentraciones analizadas. El péptido II de VP4, IV de VP6 y los de control no tuvieron efecto tóxico.

Secuencias de peptidos sinteticos

Los péptidos sintéticos de VP4 y de VP6 inhiben la infección de rotavirus en células MA104 y Caco-2. Para determinar si las secuencias de probable unión a HSC70 presentes en los péptidos sintéticos de VP4 (531-554) y de VP6 (280-297) inhibían la infección de los rotavirus de las cepas Wa, RRV y YM en células MA104 y Caco-2, las células confluentes fueron incubadas con diferentes concentraciones del péptido II (VP4), el péptido IV (VP6) o los péptidos control y posteriormente infectadas con los rotavirus.

En células MA104 y Caco-2 el péptido II de VP4 inhibió la infección de WA, RRV y YM de manera dosis dependiente. En células MA104 la inhibición fue alrededor del 79 % (Wa, RRV) y 68 % (YM) (Fig 1A).

DÉJANOS TU COMENTARIO

DEJA UNA RESPUESTA

Por favor ingrese su comentario!