Premio Aventis – Proyectos de Investigación: «Análisis de Longitud Telomérica y Actividad Telomerasa en Carcinogénesis Gástrica»

Breve Historia de La Neurocirugía, Libros de Medicina
Grupo de Patología Molecular. Facultad de Medicina. Universidad Nacional de Colombia Director: Humberto Arboleda Coinvestigadores: Juan Jose Yunis, Luis Jaime Castro, Orlando Ricaurte, William Otero Martín Gomez. Asesor: Pelayo Correa.

Libros de Medicina

El adenocarcinoma gástrico representa la segunda causa más frecuente de cáncer en el mundo, así como la segunda causa de muerte por cáncer1. Sin embargo, en regiones como Japón, Europa del Este, y Suramérica, especialmente Chile y Costa Rica esta enfermedad sigue siendo epidémica2.

En Colombia, el adenocarcinoma gástrico es un importante problema de salud pública, ya que representa la primera causa de muerte por cáncer3-5. Se estima que se detectan seis mil casos nuevos al año, con tasas de mortalidad del 24.1 por cada 100,000 habitantes para el sexo masculino y 17.4 por cada 100,000 habitantes para el sexo femenino.

Además, esta enfermedad ocasiona 54.700 años de vida saludables perdidos por año (AVISA) lo que representa el 16.3% de los AVISA por enfermedades neoplásicas y el 1% del total anual. (Lea también: Premio Aventis – Área Clínica, «Historia del Lupus»)

Según datos del Registro Poblacional de Cáncer de Cali, el cáncer gástrico en hombres es el segundo más frecuente después del cáncer de piel, continúa siendo la tercera causa de cáncer en mujeres precedido por el cáncer de cervix y seno, es la primera causa al reunir ambos sexos, y predomina en personas de edad mediana y avanzada siendo más frecuente en mayores de cincuenta años6.

Los principales aportes en el conocimiento de este tipo de cáncer en nuestro país se derivan de estudios epidemiológicos, a partir de los cuales quedaron establecidas la incidencia, prevalencia y mortalidad, las variaciones geográficas, y la identificación de factores de riesgo medioambientales7-13.

Adicionalmente, a partir del estudio histopatológico de lesiones precancerosas en poblaciones de alto riesgo, se planteó como hipótesis etiológica para la variante de tipo intestinal un proceso de carcinogénesis en múltiples pasos.

Este modelo sugiere la progresión de lesiones precancerosas que se presume es secuencial así: gastritis crónica, atrofia, metaplasia intestinal, displasia, carcinoma14-16. Se sugiere que este proceso es multifactorial ya que en él intervienen varios factores ambientales, entre los cuales se considera la infección por Helicobacter pylori17-20.

El modelo de carcinogénesis gástrica en múltiples pasos establece la acumulación de mutaciones en células de la mucosa gástrica que con el tiempo permiten el cambio en la morfología tisular.

Aunque los mecanismos moleculares de la mutagénesis química y/o biológica involucrados en la iniciación, promoción y progresión del cáncer gástrico todavía no son claros, la caracterización de las alteraciones genéticas y epigenéticas encontradas en estos tumores ha permitido conocer que genes y moléculas pueden estar implicados en estos procesos 21-30.

El mejor conocimiento de la biología tumoral gástrica, y especialmente del proceso de carcinogénesis permitirá establecer la utilidad de marcadores moleculares en el diagnóstico temprano, pronóstico, y definición de blancos terapéuticos31.

La teoría de la carcinogénesis sugiere que para el desarrollo del cáncer es necesario considerar tres procesos celulares básicos: diferenciación, proliferación y senescencia32.

Durante la progresión al estado maligno, las células cancerosas deben romper la barrera de senescencia y alcanzar la inmortalidad al adquirir una capacidad de proliferación celular ilimitada33. Uno de los mecanismos moleculares más estudiados en inmortalidad, senescencia y cáncer es la dinámica del complejo funcional telómero/telomerasa34.

Se considera que con cada división celular, los extremos de los cromosomas conocidos como telómeros se acortan hasta alcanzar el punto de senescencia celular, pues las células normales tienen una capacidad de replicación finita35-38.

Por otro lado, la expresión de telomerasa, una transcriptasa reversa que permite la síntesis de nuevo ADN telomérico, es considerada un paso fundamental para la inmortalización celular39-41.

Esta enzima se encuentra presente en las células germinales y hematopoyéticas, pero su expresión es reprimida en los otros tejidos42-44. Sin embargo, las células cancerosas reactivan la telomerasa para estabilizar el acortamiento de sus telómeros, y permitir que los clones celulares con cromosomas aberrantes tengan una capacidad de proliferación ilimitada.

La evidencia reciente sugiere que el acortamiento telomérico permite la fusión entre cromosomas, y por lo tanto contribuye a la generación de inestabilidad cromosómica en los estadios iniciales del cáncer45.

De esta forma, las células cancerosas muestran una dinámica teloméro/telomerasa característica, sus cromosomas usualmente tienen telómeros cortos y una alta actividad telomerasa.

Esto ha sido confirmado en el 85% de los cánceres analizados,46-47 sin embargo las pocas líneas de evidencia en lo que se refiere al adenocarcinoma gástrico son controvertidas y se requieren más estudios en poblaciones de alto riesgo para confirmar estos resultados.

En el presente estudio se analizará la longitud telomérica (I fase) y actividad telomerasa (II Fase) en el adenocarcinoma gástrico de tipo intestinal. El estudio de la dinámica de acortamiento telomérico y la actividad telomerasa en lesiones precancerosas permitirá evaluar desde el punto de vista molecular la progresión tumoral del proceso de carcinogénesis gástrica en múltiples pasos.

Para confirmar el modelo de carcinogénesis en múltiples pasos, será necesario establecer una correlación histológica/molecular y analizar mediante una prueba de significancia estadística las diferencias de los hallazgos moleculares que se encuentren en lesiones precancerosas, tejido tumoral y tejido sano.

En el estudio se incluirán pacientes que lleguen al servicio de Gastroenterología de las Clínicas Carlos Lleras y San Pedro Claver de Bogotá D.C, para realización de endoscopia de vías digestivas altas mas biopsia.

Con previo consentimiento informado, se obtendrán muestras de mucosa gástrica lesionada y sana del mismo paciente la cual se utilizará como control. Además también se estudiarán especímenes quirúrgicos de pacientes de la Clínica Fundadores y el Instituto Nacional de Cancerología.

La confirmación del tipo de cáncer y/o lesión precancerosa se realizará por histopatología, y el estudio molecular de las muestras comprenderá la determinación de la longitud promedio del TRF (Telomeric Restriction Fragment) de cada muestra mediante hibridización Southern blotting utilizando una sonda telomérica específica, detección por método no radioactivo, y análisis por densitometría.

La actividad telomerasa a su vez se determinará a través del ensayo TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) que comprende la extracción protéica de la muestra de tejido, amplificación por PCR y detección por método no radioactivo.

Con este estudio se busca expandir las bases científicas de la prevención secundaria del cáncer, ya que el análisis del complejo funcional telómero/telomerasa podrá utilizarse como marcador de diagnóstico molecular con utilidad en la detección temprana de lesiones con riesgo de desarrollar cáncer, así como en la detección de células tumorales en los márgenes de resección.

El valor pronóstico hará parte de estudios posteriores que evaluen la sensibilidad, especificidad y valores predictivos de este marcador frente al diagnóstico histopatológico.

1. Descripcion del proyecto

1.1 Planteamiento del Problema y Justificación

La carcinogénesis gástrica en múltiples pasos es considerada como la acumulación de mutaciones responsables de eventos secuenciales conocidos como iniciación, promoción y progresión tumoral en un lapso de 20 a 30 años, y cuya expresión fenotípica es evidenciada por el cambio en la morfología tisular15-16.

Inicialmente, este proceso secuencial fue establecido a partir del estudio histopatológico de lesiones consideradas precancerosas48,49.

Sin embargo, debido a que lesiones como metaplasia y displasia son considerados mecanismos de adaptación celular que no necesariamente progresan a cáncer, y a que existe mucha variabilidad en la interpretación subjetiva de cada examinador, los estudios de genética y biología molecular se han enfocado en determinar las bases moleculares de la carcinogénesis gástrica21 buscando una mayor precisión diagnóstica con la utilización de los marcadores moleculares.

Estudios recientes han demostrado que la secuencia de cambios morfológicos se relaciona con una serie de eventos genotípicos tales como rearreglos de la región promotora de translocación MET aparentes desde la etapa de gastritis crónica; mutaciones del oncogen k-ras con la aparición de cambios metaplásicos; mutaciones de p53 con el desarrollo de cambios displásicos; y mutación del gen DCC en el adenocarcinoma23- 29.

Si bien estas alteraciones genéticas pueden estar presentes en lesiones precancerosas, ninguna puede considerarse como marcador de progresión tumoral, ya que su presencia no es indicador de la existencia de clones inmortales, lo cual cambiaría el valor del riesgo para las lesiones que posean dicho marcador.

El mejor conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en los procesos celulares característicos de la carcinogénesis tales como senescencia, proliferación y diferenciación, ha permitido establecer la importancia del complejo funcional telómero/telomerasa en la biología de la progresión tumoral.

Los estudios sugieren que un telómero corto y una telomerasa activa forman una poderosa fuerza directriz para que las células cancerosas continúen su evolución clonal, ya que un telómero reducido y una telomerasa activa, permien generar cromosomas aberrantes y amplificar los efectos deletéreos de los mismos respectivamente45,50a,b.

De esta forma, solo aquellas lesiones precancerosas que exhiban telómeros cortos y actividad telomerasa son probablemente de mayor riesgo, pues son la evidencia objetiva de la presencia de clones celulares inmortales con gran potencial de malignidad.

El análisis del acortamiento telomérico y actividad telomerasa ha sido estudiado en modelos de carcinogénesis que muestran una progresión secuencial desde un estado premaligno hasta un estado agresivo evidenciado a partir de lesiones precancerosas51-57.

Sin embargo, la dinámica funcional del complejo telómero/ telomerasa en carcinogénesis gástrica y su significancia clínica es aún controversial.

El primer reporte de actividad telomerasa y longitud telomérica en cáncer gástrico no evaluó estos parámetros en lesionesprecancerosas,58 mientras que en otros dos estudios no se estimó la longitud telomérica de las muestras que exhibían actividad telomerasa; además, el número de displasias fue relativamente pequeño59,60.

Todos estos estudios fueron realizados a partir de especímenes quirúrgicos, y en general hay inconsistencia entre la correlación de los hallazgos moleculares y algunas variables clínicopatológicas. Por otra parte, existen pocos reportes de estudios moleculares a partir de biopsias61.

También se han utilizado otras metodologías como la detección de los componentes de telomerasa por análisis de ARNm mediante hibridización in situ o ensayos basados en anticuerpos, ya que de esta forma es posible estudiar tejido archivado62.

Aunque la expresión de la subunidad ARN (hTR), y hTERT han sido detectadas en lesiones precancerosas, 63-66 hay evidencia que sugiere que la expresión de estas no siempre es paralela a la actividad telomerasa, ya que pueden ser constitutivamente expresadas en ciertos tejidos, aún en células que no tienen normalmente actividad telomerasa67,68.

En conclusión, se requieren más estudios en poblaciones de alto riesgo para reevaluar el papel del complejo funcional telómero/ telomerasa dados los resultados anteriormente expuestos. En este sentido, el estudio planteado, será un aporte que contribuirá no solo al conocimiento en este campo de investigación, sino a las aplicaciones directas e indirectas que se derivan del mismo.

1.2 Marco teorico y estado del arte

Cáncer gástrico en el mundo Actualmente, a pesar de una marcada disminución en su incidencia, el adenocarcinoma gástrico representa la segunda causa más frecuente de cáncer en el mundo, así como la segunda causa de muerte por cáncer1.

Sin embargo, en regiones como Asia, Europa del Este, y Latinoamérica, especialmente Chile, Costa Rica y Colombia esta enfermedad sigue siendo epidémica2. El pronóstico de los pacientes con cáncer de estómago es bastante pobre, con tasas de sobrevida entre el 5 y 15% a los 5 años.

En Japón, las tasas de sobrevida han aumentado en los últimos 25 años debido a un aumento en la detección temprana de la enfermedad, y a un aumento en el número de pacientes que reciben resección curativa.

Por el contrario, en los demás países con alta incidencia, muchos casos son diagnosticados en un estadio avanzado, y la enfermedad tiene una recurrencia en al menos el 80% de los pacientes sometidos a gastrectomía69.

Cáncer gástrico en Colombia En Colombia, el cáncer gástrico sigue siendo la primera causa de mortalidad por cáncer. Se estima que se detectan seis mil casos nuevos al año, con tasas de mortalidad del 24.1 por cada 100,000 habitantes para el sexo masculino y 17.4 por cada 100,000 habitantes para el sexo femenino, lo que nos ubica en el grupo de países con alta tasa de mortalidad por cáncer gástrico cuya tendencia se ha mantenido constante en los últimos años.

Se calcula además, que esta enfermedad ocasiona 54.700 años de vida saludables perdidos por año (AVISA) lo que representa el 16.3% de los AVISA por enfermedades neoplásicas y el 1% del total anual.

Según datos del Registro Poblacional de Cáncer de Cali, el cáncer gástrico pasó de ser la primera causa de cáncer en hombres al segundo lugar después del cáncer de piel en el quinquenio92- 96, continúa siendo la tercera causa de cáncer en mujeres precedido por el cáncer de cervix y seno, predomina en personas de edad mediana y avanzada, es más frecuente en mayores de cincuenta años y ocurre excepcionalmente en personas menores de treinta años3-6.

Estudios epidemiológicos y patológicos En 1970 gracias a la iniciativa del Dr. Pelayo Correa, se realizaron los estudios de epidemiología descriptiva del cáncer gástrico en Colombia, a partir de los cuales se demostró una alta incidencia en poblaciones como Nariño, Cauca, el Altiplano Cundiboyacense y el Oriente Antioqueño.

Al estudiar la frecuencia de tipos histológicos, se encontró que en estas poblaciones de alto riesgo, el carcinoma gástrico de tipo intestinal prevalece sobre el de tipo difuso, el cual a su vez es más frecuente en poblaciones de bajo riesgo como Cartagena.

También quedaron establecidos factores de riesgo medioambientales, principalmente relacionados con hábitos alimenticios, una flora bacteriana en la cavidad gástrica capaz de reducir nitratos a nitritos, y altas concentraciones de nitratos en aguas de aljibes de las poblaciones de mayor riesgo7-13.

Con base en todos estos estudios se planteó una hipótesis causal en la cual se considera que la variedad intestinal o epidémica del carcinoma gástrico, es el resultado final de un proceso multifactorial en múltiples pasos, en el cual los factores medioambientales son muy importantes.

El modelo sugiere la progresión de lesiones precancerosas en un proceso de carcinogénesis que se presume es secuencial así: gastritis crónica – atrofia – metaplasia intestinal – displasia, ya que al estudiar la historia natural de estas lesiones se pudo demostrar que cada una de estas alteraciones morfológicas se asocian con un incremento del riesgo para cáncer gástrico.

Además se estableció que los cambios fenotípicos de la mucosa gástrica requieren un largo período de incubación14-16. La evidencia reciente sugiere además que la infección por Helicobacter pylori en las edades tempranas de la vida también es un factor de riesgo importante17-20.

El mecanismo de carcinogénesistodavía no está muy claro pero se considera que induce la proliferación celular, permite la progesión de gastritis a atrofia, y estimula una respuesta inflamatoria que con el tiempo es genotóxica, ya que el estrés oxidativo de especies reactivas del oxígeno generadas por monocitos y polimorfonucleares tiene potencial carcinogénico causando alteraciones genéticas en la mucosa gástrica20b.

Carcinogénesis en múltiples pasos El modelo del Dr. Correa establece la acumulación de mutaciones en las células de la mucosa gástrica que con el tiempo permiten el cambio en la morfología tisular.

Aunque los mecanismos moleculares de la mutagénesis química y/o biológica involucrados en la iniciación y promoción del cáncer gástrico todavía no son claros, la caracterización de las alteraciones genéticas y epigenéticas encontradas en estos tumores ha permitido conocer que genes y moléculas pueden estar implicados en la progresión tumoral21.

Se observa por ejemplo, la secuencia de cambios morfológicos aariba mencionados; y acortamiento del telómero y actividad telomerasa en metaplasia, displasia y pólipos hiperplásicos23- 29.

De esta forma, será posible plantear modelos que evidencien las bases moleculares del proceso de carcinogénesis en múltiples pasos para el adenocarcinoma gástrico, de manera similar a como fue planteado para el cáncer colorectal.

La teoría de la carcinogénesis sugiere que la proliferación celular ilimitada es requerida para el desarrollo de la enfermedad maligna, y que las células cancerosas deben alcanzar la inmortalidad para la progresión al estado maligno39.

Los avances en genética y biología molecular han permitido la comprensión de algunos mecanismos responsables de estos procesos, principalmente en lo que se refiere al papel del complejo funcional telómero/telomerasa.

Esto ha permitido evaluar su utilidad como marcador de progresión tumoral en varios tipos de cánceres, lo cual puede ser útil como herramienta diagnóstica temprana, ya que su presencia en lesiones precancerosas son la evidencia objetiva de clones celulares inmortales con mayor riesgo de progresión a cáncer, pues lesiones como metaplasia o displasia son consideradas desde el punto de vista histopatológico mecanismos de adaptación celular que no necesariamente progresan a neoplasia.

Además, dado que la telomerasa no se expresa en tejidos normales adyacentes al tejido tumoral, su presencia puede permitir en algunos casos la detección de células tumorales en los márgenes de resección.

Telómeros

Los telómeros son estructuras nucleoprotéicas complejas que consisten en una secuencia repetitiva de ADN ubicada en los extremos de los cromosomas, y proteínas asociadas. Para los humanos y muchos otros organismos, esta secuencia es (5′-TTAGGG-3′)n extendida a lo largo de aproximadamente 8-14 kb.70,71.

La mayoría del ADN telomérico existe en una conformación de doble hebra, sin embargo, las últimas secuencias de la cadena rica en guaninas orientada en la dirección 5′-3′ conforman una única hebra de ADN72a,b.

Esta hebra puede adoptar un número de configuraciones de apareamiento de bases no convencional formando estructuras conocidas como G-cuadruplex en asociación con proteínas de unión a cadena sencilla de ADN73.

Esta estructura tridimensional evita que los extremos cromosómicos sean reconocidos como un extremo libre de ADN dañado, lo cual llevaría a una parada del ciclo celular y la activación de los mecanismos de reparación del ADN para reestablecer los extremos fragmentados.

Además de proteger los extremos cromosómicos de eventos como recombinación, fusión y degradación por exonucleasa y ligasas, los telómeros también participan en procesos nucleares tales como represión transcripcional (efecto de posición del telómero), formación de heterocromatina, regulación del apareamiento y separación de cromosomas homólogos durante la mitosis, y organización espacial de los cromosomas (topología) en la matriz nuclear74.

Los telómeros son metabolizados por un acortamiento progresivo a partir de la replicación del ADN en cultivos de células humanas normales, y también con la edad in vivo35-38,75,76.

En cada división celular, los telómeros pierden 50-200 bp en el extremo 3′ de la molécula de ADN, reflejando la inhabilidad de las polimerasas de ADN convencionales para replicar los extremos de los cromosomas, y los efectos de la exonucleasa 5′-3′.

Se ha sugerido que este problema de la replicación de los extremos77 opera como un reloj mitótico a través del cual la célula contabiliza el número de divisiones celulares hasta llegar al punto de senescencia celular, convirtiéndose en un importante mecanismo de control ya que se conoce que las células inmortalizadas mantienen la longitud telomérica para incrementar el número de divisiones celulares78,79.

Para compensar el acortamiento telomérico, los organismos han desarrollado complejos mecanismos. Por ejemplo, en células humanas, el principal mecanismo es la síntesis de novo de los telómeros por la telomerasa, una enzima que elonga la cadena sencilla de ADN telomérico en la fase S del ciclo celular80.

En Drosophila melanogaster, el ADN telomérico puede ser elongado por transposición de retrotransposones específicos (HeT-A y TART) a los extremos cromosómicos, mientras que en otros organismos la extensión de los telómeros puede ocurrir por recombinación81,82.

De esta forma, la longitud de los telómeros depende de una dinámica de equilibrio entre la tasa de acortamiento de ADN telomérico dependiente de la replicación,y el grado de alargamiento compensatorio a través de procesos tales como la reactivación de telomerasa.

Otro grupo de importantes reguladores de la función del telómero son las proteínas de unión al telómero. En levaduras, las proteínas de unión al telómero son las proteínas de unión a cadena doble Rap1 y Taz1p, y las proteínas de unión a cadena sencilla Rif6p, Cdc13, Est1p y Est2p83.

En humanos, los factores de unión a cadena doble son TRF1 y TRF2, y las proteínas de unión a cadena sencilla son TERT, proteína asociada a telomerasa 1 TEP1, y hnRNP A184,85. Las proteínas de unión al ADN telomérico forman un complejo de orden superior que reconocen al telómero de una manera específica de secuencia, y además tienen interacciones con otras proteínas.

Estas proteínas interactúan a través de interacciones proteína-proteína y comprometen un gran dominio cromosómico funcional llamado «telosoma». Ejemplos de estas proteínas son SIR3/SIR4 y la proteína RIF1 en Saccharomyces cerevisiae. Estas proteínas se asocian con RAP1 y estabilizan el telómero silenciándolo y regulando su longitud respectivamente83.

La longitud del telómero humano se mide usualmente por análisis Southern blot en el cual, el ADN genómico previamente aislado del material de estudio es digerido con una o varias enzimas de restricción.

Posteriormente, los fragmentos de restricción terminal (TRF) son hibridizados con una sonda telomérica, y finalmente se hace una cuantificación densitométrica de la señal145,146.Telomerasa La enzima dependiente de ARN denominada transferasa terminal o telomerasa fue identificada inicialmente en Tetrahymena como un complejo ribonucleoprotéico que utiliza secuencias de su propio ARN como templete para la síntesis de novo de secuencias de ADN telomérico.86,87

Estudios posteriores en otros organismos, incluyendo humanos han permitido la clonación molecular de los componentes de la holoenzima ((300 kDa).88 Un grupo funcional cataliza la adición de nucleótidos en la cadena sencilla de ADN telomérico orientado en la dirección 5′-3′ mientras que la síntesis de la hebra complementaria esta mediada por la ADN polimerasa convencional. Los mecanismos básicos de reacción de la telomerasa son reconocimiento, apareamiento adición de nucleótidos y traslocación89,90.

La subunidad catalítica de la telomerasa humana es una ADN polimerasa dependiente de ARN o transcriptasa reversa hTERT (Human Telomerase Reverse Transcriptase)91 que utiliza el componente ARN (hTR) como templete para elongar la cadena sencilla de ADN 3′ gracias a la síntesis de novo de secuencias teloméricas.

El análisis del gen que codifica hTR reveló que tiene 445 nucleótidos, y la presencia de la secuencia (5′-CUAACCCUAAC-3′) que codifica para la secuencia telomérica (TTAGGG)n88.

La subunidad ARN además de servir como templete, también está implicada en el sitio activo enzimático, probablemente con nucleótidos específicos interactuando con componentes estructurales del sustrato primer de ADN y las subunidades protéicas.

El complejo holoenzima telomerasa humana también comprende la proteína hTEP1 requerida para el ensamblaje y la actividad de la enzima83b. Estas y otras proteínas pueden funcionar como elementos regulatorios de la procesividad de la enzima83.

Sin embargo, se reconoce que solo la proteína catalítica hTERT es el factor limitante de la activación de telomerasa, por lo cual la regulación de su expresión puede ser un factor clave en la extensión de la replicación celular y la inmortalización92.

Muchos tejidos exhiben actividad telomerasa durante el desarrollo embriónico temprano con la subsecuente represión en la medida que progresa la diferenciación celular93. Esta situación es paralela con la pérdida de la actividad telomerasa en células inmortales tratadas con inductores de la diferenciación94.

El mecanismo por el cual la telomerasa es reprimida en tejidos somáticos normales parece involucrar la regulación transcripcional y postranscripcional del gen hTERT95.

El ensayo TRAP (Telomere Repeat Amplification Protocol), es utilizado para probar la actividad telomerasa. Este incluye la preparación de un extracto protéico por lisis celular y adición de dNTPs. Si la telomerasa es activa en el extracto, esta elonga el templete, y el producto de elongación es amplificado por PCR. Usando este protocolo de amplificación, es posible detectar una célula telomerasa positiva entre 10,00096,145.

Modelo de crisis telomérica

Los estudios usando modelos de cultivo celular indicaron que las células para hacerse inmortales necesitan vencer dos estadíos críticos, los estadíos de Mortalidad 1 (M1) y 2 (M2).

El acortamiento del telómero hasta un punto crítico conduce a una parada de la proliferación sin pérdida de la función bioquímica o la viabilidad (M1).

Una hipótesis para la inducción de M1 sugiere que el acortamiento del telómero produce una señal de daño del ADN, lo cual induce p53 y p21. A su vez, p21 inhibe las CDK previniendo la fosforilación de pRb. La presencia de pRb desfosforilado se acopla con otras acciones de p53 y p21 resultando en la parada M1.

Si estos reguladores del ciclo celular son mutados o bloqueados, las células continuan dividiéndose hasta alcanzar M2 y así los telómeros continúan acortándose. Algunas células murinas y casos raros de células humanas vencen este estadío M2 y crecen inmortalmente en cultivo. Se ha encontrado que la telomerasa es reactivada concomitantemente para sobrepasar M2.

Estas observaciones de células inmortalizadas in vitro llevaron a proponer que las células cancerosas activan la telomerasa para crecer inmortalmente. Este modelo de «crisis telomérica» ha sido enmarcado dentro de la teoría de la evolución clonal del cáncer50a.

Cuando dos cromosomas pierden la función del telómero, se hacen inestables y se fusionan el uno al otro generando lo que se conoce como cromosoma dicéntrico45.

Durante la mitosis, los dos centrómeros son separados por el huso, y como resultado de la tensión mecánica, se genera una nueva fragmentación, y los dos cromosomas resultantes no tienen telómeros funcionales llevando así a un nuevo ciclo de fusión.

Una variedad de cromosomas aberrantes son producidos por este mecanismo. Sin embargo, mientras la telomerasa no sea activada, el nuevo cromosoma formado seguirá sin telómero funcional, y las células sujetas a estos ciclos eventualmente mueren.

Sin embargo, si las células tienen un telómero reducido y telomerasa activa, ello puede activamente producir cromosomas aberrantes y estables. Bajo estas condiciones, la oportunidad para formar un cromosoma modificado se incrementará significativamente.

Esta habilidad da una ventaja enorme a las células cancerosas, por lo cual se ha sugerido que un telómero corto y una telomerasa activa forman una poderosa fuerza directriz para que las células cancerosas continúen con su evolución clonal50a,b.

Evidencia clínica Cerca del 85% de los tumores sólidos tienen actividad telomerasa detectable, y fragmentos de restricción terminal (TRF) cromosómicos con una longitud dramáticamente reducida a 2-4 kb a diferencia de la línea germinal y células fetales con 20 kb46,47.

La siguiente descripción es un resumen de lo que ha sido reportado hasta la fecha describiendo las implicaciones de la biología del complejo funcional telómero/telomerasa en el desarrollo del cáncer.

Los tumores con telómeros más cortos que el tejido original han sido detectados en muchos tipos de cáncer. En neuroblastoma, cáncer endometrial, cáncer de mama, leucemias y cáncer de pulmón, una correlación entre la disminución de la longitud del telómero y un incremento en la severidad de la enfermedad han sido descritos97-102.

Los tumores con telómeros igual o más largos que el tejido normal original son raros pero han sido descritos en tumores intracraneales, carcinoma de células basales y carcinoma de células renales103-106.

Sin embargo, es posible que la telomerasa (cuya actividad no fue estudiada) elongara los telómeros, o que las células tumorales no hayan tenido aún bastantes divisiones celulares para inducir el acortamiento de los telómeros.

Por esta razón, para describir la dinámica del telómero de las células cancerosas en relación con el mecanismo del desarrollo del cáncer, es importante considerar tanto la longitud del telómero como la actividad telomerasa, ya que ninguno de los dos por separado es prueba suficiente de cáncer.

La alta sensibilidad del ensayo TRAP ha permitido el análisis de muestras de tejido mínimas, tales como aspirado con aguja fina de mama y tiroides, extendidos cervicales, células tumorales en líquido ascítico, y lavados orales y urinarios107-119.

La sensibilidad y especificidad de estos ensayos en la detección de células tumorales en estos especímenes ha sido superior que el estándar de oro citológico.

También hay evidencia acerca de la alta actividad telomerasa correlacionada con peor pronóstico en leucemias, meningiomas, neuroblastomas, y cánceres de mama, colorectal y de pulmón120-127.

Por ejemplo, la longitud del telómero fue reducida en todos los casos de leucemia mieloide aguda (LMA) y crónica (LMC) comparados con células sanguíneas normales derivadas de grupos de edad similares. En cuanto a la actividad telomerasa, todos los casos de LMC en fase crónica mostraron muy bajos niveles de actividad, similares a los encontrados en las células sanguíneas.

En contraste todos los casos de crisis blástica mostraron altos niveles de actividad120. De esta forma se demostró que la telomerasa es altamente activa durante la progresión de la enfermedad. De la misma forma ciertos tipos de tumor tales como el neuroblastoma, muestran la actividad telomerasa más baja en los estadios iniciales del cáncer, mientras que la expresión en los estadíos tardíos es mayor.

En un estudio, los neuroblastomas de estadio IV, los cuales tienen telómeros cortos y ninguna o débil actividad telomerasa, regresaron espontáneamente, posiblemente como prueba de la correlación entre una muy débil actividad de la enzima para permitir un estado de inmortalidad, y un resultado favorable para el paciente123.

Así, la determinación de la actividad telomerasa puede ser particularmente importante en la evaluación de los bordes del tumor en pacientes bajo terapia para predecir el riesgo de recidiva.

La utilidad de los marcadores tumorales es a menudo medida por su efectividad en la detección temprana de lesiones premalignas. Los ensayos de actividad telomerasa han sido aplicados a un número de órganos donde las lesiones exhiben estadios precancerosos bien definidos51-57.

En tejido cervical uterino, la progresión de neoplasia intraepitelial cervical a carcinoma franco se correlaciona con un incremento en los porcentajes de células telomerasa positivas52. En lesiones de próstata hay una correlación similar entre la actividad telomerasa y la progresión de neoplasia intraepitelial prostática a cáncer de próstata51.

De esta forma, la detección de la actividad telomerasa en estadios de crecimiento preneoplásicos y benignos puede significar progresión de la enfermedad y ser de valor diagnóstico. Por ejemplo, la actividad telomerasa ha sido encontrada en algunos casos de hiperplasia prostática benigna y tumores gigantes benignos de hueso, tejidos que pueden progresar a tumores malignos128,129.

En tumores premalignos y benignos, incluyendo enfermedad fibroquística de la mama y fibroadenomas, hiperplasia prostática benigna, adenoma colorectal, astrocitoma anaplásico meningiomas y leiomiomas benignos, la actividad telomerasa detectada fue debil; sin embargo, se encontró en los estadios tumorales malignos124,128-131.

De esta forma, la actividad telomerasa se asocia con la adquisición de malignidad. Por otra parte, algunos tumores tienen una baja incidencia de actividad telomerasa. Por ejemplo, la actividad está presente en el 50% de las muestras de glioblastomas y retinoblastomas, y la actividad se encuentra raramente en astrocitomas y meningiomas132,133,130.

Los investigadores han reportado la elongación en células humanas inmortales sin actividad telomerasa detectable134-136. No está claro aún si la estabilización del telómero en éstas células es alcanzado por mecanismos de recombinación o transposición, o si las células transformadas pueden desarrollar mecanismos alternativos para hacer frente a cualquier posible inhibición de la telomerasa.

La detección de la actividad telomerasa en tejidos que normalmente tienen actividad telomerasa tales como leucemias y lesiones de endometrio presentan dificultades en la interpretación como indicador de estado tumoral137,138.

El análisis de posibles lesiones malignas en nódulos linfáticos es también complicada por el hecho de que nódulos linfáticos benignos han demostrado actividad telomerasa139. Además, el ensayo TRAP puede detectar el 0.01% de células telomerasa positivas en una mezcla de poblaciones celulares.

De esta forma, en tejidos de tumor homogeneizados, pequeños números de células madre positivas o linfocitos pueden alterar los resultados140. En otros estudios también se ha estimado la expresión de las subunidades de telomerasa hTR y hTERT141,142.

Sin embargo, la correlación de estas con la actividad telomerasa no siempre es paralela67,68. Por último, también se ha estimado el valor de hTERT en suero de pacientes con cáncer, sin embargo hacen falta más estudios al respecto143. En conclusión, la actividad telomerasa es un marcador tumoral confiable, pero no es un fenómeno del todo o nada.

Son necesarios por lo tanto más estudios clínicos retrospectivos y prospectivos con grandes números de muestras y seguimiento clínico para evaluar la validez de la dinámica del telómero y la telomerasa como marcadores diagnósticos y pronósticos en muchos tipos de cáncer.

1.3 Objetivos Objetivo general

Evaluar el papel de la longitud telomérica y actividad telomerasa en la progresión tumoral a partir de biopsias y especimenes quirúrgicos en una muestra de población colombiana con diagnóstico patológico de lesiones precancerosas y/o adenocarcinoma gástrico tipo intestinal.

Objetivos específicos

1. Analizar el grado de longitud telomérica y actividad telomerasa en adenocarcinomas gástricos de tipo intestinal a partir de tejido biopsiado y especímenes quirúrgicos.

2. Determinar el grado de longitud telomérica y actividad telomerasa en lesiones precancerosas tales como: gastritis atrófica, metaplasia intestinal y displasia gástrica a partir de biopsias de mucosa gástrica y especímenes quirúrgicos.

3. Correlacionar el análisis de longitud telomérica y actividad telomerasa con los diagnósticos histopatológicos de lesiones precancerosas, cáncer y mucosa gástrica sana del mismo paciente.

4. Correlacionar el análisis de longitud telomérica y actividad telomerasa con las siguientes variables clinicopatológicas: género, edad, localización del tumor (cardial, fundocorporal o gastropilórica), tamaño del tumor, grado de invasión, grado de displasia y estadiaje TNM.

5. Estimar la correlación entre la actividad telomerasa y la longitud telomérica de las muestras de estudio.

6. Establecer una cohorte para estudios posteriores tendientes a valorar sensibilidad, especificidad y valores predictivos de los marcadores moleculares frente a la histopatología convencional.

1.4 Metodología Tipo de estudio:

Estudio piloto no experimental/ Analítico/Casos y Controles/Transversal Población de estudio: Pacientes del servicio de Gastroenterología y Endoscopia de la Clínica Los Fundadores, y del servicio de Cirugía de la Clínica San Pedro Claver e Instituto Nacional de Cancerología Bogotá D.C. Casos:

En el estudio se seleccionarán durante el período Enero-Junio de 2004 cincuenta pacientes con evidencia endoscópica y/o histopatológica de adenocarcinoma gástrico de tipo intestinal y/o lesiones precancerosas tales como, gastritis atrófica, metaplasia intestinal o displasia gástrica.

Los pacientes pueden presentar cualquier sexo y edad, tendrán una historia clínica detallada y firmarán el respectivo consentimiento informado.

Controles: Muestras de mucosa gástrica sana de la población de estudio. Endoscopia y biopsia El examen endoscópico será realizado en la forma usual por un endoscopista experimentado, con el paciente en decúbito lateral izquierdo, y aplicación de lidocaína «spray» en la orofaringe y sin sedación.

Se utilizará equipo de videoscopia EVIS 140 para realizar la ubicación y clasificación endoscópica de las lesiones, y se tomarán biopsias según el Sistema Sydney (dos muestras del antro, una de la incisura angularis y dos del cuerpo) con pinza Jumbo para lograr una muestra de aproximadamente 50-100 mg.

Un set de biopsias será para estudio histopatológico convencional por lo cual se sumergirán las muestras en formol tamponado al 2% y se enviarán al laboratorio de Patología.

El otro set de biopsias será para estudio de biología molecular para lo cual se congelarán inmediatamente en nitrógeno líquido para ser transportadas al laboratorio del Instituto de Genética -UN donde se almacenarán a -80°C hasta su uso.

Todas las muestras serán codificadas y se almacenarán los datos en la base de datos Access para el posterior análisis. Especímenes Quirúrgicos Se recuperará la pieza quirúrgica de los pacientes con cáncer sometidos a gastrectomía e inmediatamente se realizará la anatomía macroscópica.

Se realizará la clasificación TNM144 y se ubicarán y registrarán las regiones de interés para tomar las correspondientes muestras de tejido lesionado y mucosa sana las cuales serán sometidas a estudio histopatológico y de biología molecular.

Estas muestras se conservarán en formol tamponado al 2% y nitrógeno líquido respectivamente. Estas últimas se almacenarán a -80°C hasta su uso.

Diagnóstico Patológico

Al menos dos patólogos expertos realizarán en consenso el estudio de anatomía microscópica de biopsias y especímenes quirúrgicos. La histología se realizará utilizando coloración de hematoxilina eosina.

No obstante, tomando en cuenta las equivalencias entre las diferentes nomenclaturas145, se seguirán los criterios de Lauren146 para reportar el tipo de adenocarcinoma gástrico, la nomenclatura de Riddell147 para el grado de displasia, y la nomenclatura Sydney para valorar tanto la densidad del infiltrado inflamatorio como el grado de atrofia glandular148.

Además se reportará sobre la base de su morfología el tipo de metaplasia intestinal como completa e incompleta según sea el caso149.

Estudio Molecular de Muestras: Cada muestra de estudio será dividida en dos grupos, uno de ellos para realizar el análisis de longitud telómerica mediante hibridización southern blotting, y el otro para determinar la actividad telomerasa a partir del ensayo TRAP.

Probablemente no todas las muestras sean analizadas para actividad telomerasa dada la limitante en la cantidad de tejido disponible.

Ensayo para establecer la longitud telomérica

El análisis para establecer la longitud telomérica, ha sido tradicionalmente a través de Sourthern blotting. En términos generales, debe aislarse la población celular de estudio, y purificar el ADN genómico.

Posteriormente, este ADN es digerido con enzimas de restricción cuya secuencia de corte no involucra la región telomérica. De esta forma, el ADN es cortado en pequeños fragmentos dejando indemne el Fragmento de Restricción Terminal (TRF) compuesto por el telómero y la región subtelomérica.

Los fragmentos de ADN son separados en un gel de agarosa y transferidos a una membrana para el análisis Sourthern blotting. La hibridización se hace con una sonda específica para la secuencia telomérica.

La detección de la posición de la sonda hibridizada sobre la membrana puede ser realizada utilizando un sistema de quimioluminiscencia o radiactivo. Finalmente, el la longitud promedio del TRF de cada muestra de estudio se calcula a partir de la posición de la señal detectada con respecto a la posición de estándares de tamaño conocido150,151.

Aislamiento de ADN: Para el aislamiento de ADN de las muestras de estudio se utilizará el protocolo para aislamiento de ADN de tejido QIAamp DNA Mini Kit,152 y se confirmará la ausencia de degradación por electroforesis.

Digestión de ADN genómico: La digestión de ADN genómico se realizará utilizando una mezcla de endonucleasas de restricción RsaI/HinfI, al menos 2.5µg ADN por muestra serán utilizados. Los fragmentos de ADN se resolverán en un gel de agarosa al 0.8%.

El gel se correrá a 20V por 25 horas. Southern Blotting: Se utilizará una membrana de nylon cargada positivamente y se usará buffer alcalino NaOH. La transferencia se hará a temperatura ambiente toda la noche.

Hibridización: Se adicionará la sonda telomérica marcada con digoxigenina al buffer de hibridización y se realizará la detección por quimioluminisencia con lumiphos 530. Cálculo de la longitud telomérica: Este cálculo puede obtenerse, comparando visualmente el tamaño del barrido obtenido de la muestra de estudio con eldel marcador de peso molecular Lambda Hind III.

La longitud del telómero de cada muestra se estimará como el cálculo de la longitud telomérica promedio. Se medirá tanto el grado de acortamiento como la señal de intensidad telomérica a partir del análisis densitométrico.

Ensayo TRAP para determinar actividad telomerasa El ensayo para determinar la actividad telomerasa en extractos celulares es denominado TRAP (Telomere Repeat Amplification Protocol), e incluye la preparación de un extracto protéico por lisis celular y adición de dNTPs. Si la telomerasa es activa en el extracto, esta elonga el templete, y el producto de elongación es amplificado por PCR.

Estos productos son después visualizados utilizando fluorocromos de ADN altamente sensibles, o por autoradiografía después de utilizar un primer marcado radioactivamente. El número, y la intensidad de la secuencia telomérica son usados como medida de la actividad telomerasa en el tejido de estudio.

Usando este protocolo de amplificación, es posible detectar una célula telomerasa positiva entre 10,000. Determinación de la concentración proteica: Se utilizarán dos soluciones stock de 0.1 mg/ml y 1 mg/ ml de BSA, se prepararán varias concentraciones estándar de BSA con buffer de lisis.

Para cada estándar se preparará un volumen total de 50 µl. Se utilizará reactivo de Coomassie, y se utilizarán 50 µl de cada extracto celular. Se elaborará la curva estándar usando los datos de OD595 de varias muestras estándar y se utilizará esta curva para determinar la concentración de proteína del extracto de tejido.

Amplificación por PCR: Para detectar la actividad telomerasa, a la muestra que contiene telomerasa se adicionarán secuencias teloméricas en el extremo 3′ del primer sintético TS. En un segundo paso, los productos de telomerasa extendidos se amplificarán por PCR utilizando los primers TS y RP.

La actividad telomerasa se establecerá a partir de la detección de fluorocromo por método no radiactivo. Cada tubo contendrá aproximadamente 48 µl de mezcla maestra, 2 µl de muestra, y 200 µl de aceite mineral.

Los ciclos podrán programarse como sigue: 30°C/10-30 min para un ciclo, y luego 94°C/30 seg y 60°C/30 seg para 25- 30 ciclos. Además se sugiere un rango de temperatura entre 50°C-60°C. PAGE: Se preparará una PAGE vertical al 12.5- 15% en TBE 0.5X para resolver los productos de PCR. Las muestras se correrán a 500V por 1 hora.

Finalmente para visualizar el material de estudio se utilizará una dilución 1/10000 de verde SYBR por 30 min, y posteriormente se utilizará una fuente UV. El control interno TSNT aparecerá como una banda de 36 pb, y el producto más pequeño de telomerasa será de 50 pb.

Cuantificar la actividad Telomerasa: El nivel de telomerasa en una muestra es determinado al comparar la señal obtenida de la muestra de cada carril con la señal de la muestra obtenida utilizando cantidades conocidas estándar.

El oligonucleótido R8 estándar usado para el ensayo TRAP contiene la misma secuencia del producto de telomerasa de 8 secuencias. Con este estándar, se observa un patrón característico de 6 bandas que corresponden del primero al sexto producto TRAP observado. También se utilizará la línea celular Hela como control positivo.

El control interno TSNT es la banda más pequeña de 36 bp y estará presente en cada carril incluyendo el buffer control negativo, la muestra control tratada con calor y las muestras de estudio. La siguiente banda TRAP más pequeña será de 50 bp, y todas las siguientes bandas tendrán incrementos de 6 bp (56, 62 y 68 bp, e.t.c.).

Análisis estadístico Las muestras de estudio serán divididas en dos grupos, uno con actividad telomerasa detectable y otro con actividad telomerasa indetectable.

Entre estos dos grupos se compararán datos clínicopatológicos tales como: género, edad, tipo de lesión precancerosa, tamaño del tumor, localización del tumor, grado de invasión, grado de displasia, estadiaje TNM y alteraciones del TRF mediante un test de Fisher ó X2.

El grado de significancia estadística lo darán valores de P <0.05. La longitud telomérica de muestras telomerasa positivas de lesiones precancerosas y adenocarcinomas se comparará con la de muestras telomerasa negativas de mucosa gástrica sana correspondiente mediante la prueba estadística t de Student.

1.5 Disposiciones vigentes

Consideraciones éticas La metodología y el manejo de la información dentro de esta investigación se encuentra en el marco de la legislación nacional, cumpliendo lo estipulado por el Ministerio de Salud en lo concerniente a la reglamentación en ciencia y tecnología, Resolución No. 008430 de 1993, en la cual se establecen las normas científicas, técnicas y administrativas para el desarrollo de la actividad investigativa en salud154.

El Comité de ética, previo aval del Comité de Investigación de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia evaluó de manera crítica la pertinencia de la propuesta y formuló las respectivas sugerencias.

El estudio propuesto se fundamenta sobre la base de estudios previos realizados por investigadores principalmente Japoneses y aún Colombianos en los que se ha estudiado la historia natural de las lesionesprecancerosas, inicialmente a partir de la histopatología convencional y más recientemente con la búsqueda de marcadores de progresión tumoral a partir de material biológico obtenido mediante endoscopia.

En estos estudios se ha demostrado que este tipo de procedimiento convencional en la evaluación gastroenterológica no confiere riesgos significativos, y que por el contrario, las endoscopias seriadas en poblaciones de alto riesgo han demostrado ser de gran beneficio, ya que de esta forma se ha logrado la disminución de la mortalidad por cáncer de estómago cuando éste se detecta a tiempo.

Teniendo en cuenta que la participación de los pacientes dentro del proyecto ofrece un riesgo mayor que el mínimo, puesto que la toma de biopsias por endoscopia es un método invasivo, es importante aclarar que este procedimiento se realizará por un endoscopista experto y que se aclararán con detalle a cada paciente que desee participar en la investigación tanto los riesgos mínimos como los beneficios del mismo.

La selección de los pacientes se realizará con la independencia y voluntad de cada una de sus familias o de los individuos en particular, en la que expresan su deseo de participar en la investigación y la firma del consentimiento informado respectivo, mediante el cual el sujeto de investigación o en su caso, su representante legal, autoriza su participación en la investigación, con pleno conocimiento de la naturaleza de los procedimientos, beneficios y riesgos a que se someterá, con la capacidad de libre elección y sin coacción alguna.

Para proteger la privacidad del individuo sujeto de investigación, en todo momento se mantendrá la más estricta confidencialidad y su nombre no será mencionado en ninguno de los informes acerca del estudio, identificándolo solo cuando los resultados lo requieran y éste lo autorice.

Además, para todos los individuos se tomarán en cuenta el respeto a su dignidad y la protección de sus derechos y su bienestar. Por lo tanto, si cualquiera de ellos desea no continuar en la investigación, será respetada su decisión sin que esto afecte la calidad de sus servicios médicos.

Así mismo se tomarán las medidas pertinentes para evitar cualquier riesgo o daño a los sujetos de investigación, y si esto ocurre, se proporcionará la atención médica para aliviar el problema al sujeto que sufra algún daño sin perjuicio de la indemnización que legalmente le corresponda.

1.6 Resultados/Productos esperados y potenciales beneficiarios

Con este estudio se espera identificar el grado de longitud telomérica en adenocarcinomas gástricos de tipo intestinal, y lesiones precancerosas tales como gastritis atrófica, metaplasia intestinal y displasia para correlacionarlas con variables clínicopatológicas.

Esta investigación permitirá determinar la utilidad de este marcador molecular en el diagnóstico temprano de lesiones con riesgo de progresión a cáncer gástrico.

Este estudio permitirá complementar los trabajos que actualmente se están llevando a cabo en el Instituto de Genética de la Universidad Nacional de Colombia, por parte del Grupo de Patología Molecular, los cuales buscan caracterizar las principales alteraciones genéticas del proceso de carcinogénesis gástrica a partir de tejido archivado. En esta oportunidad, se analizará la parte correspondiente a la longitud telomérica en tejido fresco.

El desarrollo de este tipo de proyectos permitirá la introducción en la Universidad Nacional de Colombia y particularmente en el Departamento de Patología de metodologías moleculares que ayuden a esclarecer la patogénesis de las enfermedades, con impacto en el diagnóstico y pronóstico de diferentes patologías, así como la creación de un grupo interdisciplinario para el estudio molecular de enfermedades con vinculación de estudiantes de posgrado para la realización de proyectos de investigación encaminados a generar conocimiento en las áreas de la Patología Molecular y la Biología Tumoral, contribuyendo con ello a la promoción, formación y capacitación de personal científico de alta calidad.

Este tipo de conocimiento permitirá generar una utilidad clínica, ya que de el podrán beneficiarse gastroenterólogos, patólogos, oncólogos y por supuesto pacientes con adenocarcinoma gástrico.

Una vez finalizado el proyecto, los resultados obtenidos serán publicados en un artículo en revista internacional arbitrada, y se llevarán a cabo conferencias en eventos nacionales e internacionales presentando los resultados de los mismos.

Así, de esta investigación también podrán beneficiarán grupos de investigación nacionales e internacionales, al tener acceso a la información generada en esta propuesta, lo cual repercutirá en la formulación de convenios, contratos y proyectos interinstitucionales.

Además, estos resultados también serán difundidos en medios masivos de comunicación como reportajes que permitan al público en general conocer los desarrollos y resultados de la propuesta. moleculares con el objetivo de incursionarlas en la clínica y de esta forma disminuir las tasas de mortalidad por cáncer gástrico.

1.8 Impacto ambiental del proyecto

La ejecución del proyecto de investigación propuesto no confiere un impacto ambiental negativo. Además se aclara que no se manipulará material radioactivo y se garantiza que se manejarán adecuadamente los residuos químicos de laboratorio por parte del personal del Instituto de Genética encargado para ello.

1.9 Trayectoria del grupo investigador

El Investigador principal y los Coinvestigadores de la propuesta cuyas hojas de vida están registradas en el GrupLAC y CvLAC conforman el Grupo de Patología Molecular de la Universidad Nacional de Colombia, el cual culminó recientemente un estudio tendiente a caracterizar las principales alteraciones genéticas del proceso de carcinogénesis gástrica, específicamente realizando microdisección manual, inmunohistoquímica para p53 y análisis mutacional de los genes p53, APC, MCC y K-ras en metaplasia intestinal, displasia y adenocarcinoma gástrico a partir de tejido archivado.

Actualmente, se está adelantando la primera fase del presente proyecto (Análisis de Longitud Telomérica) con recursos de Colciencias y esperamos continuar pronto con la segunda fase (Expresión de Telomerasa).

Además, también se planteará la posibililidad de estudiar la expresión de proteínas asociadas al telómero tales como TRF1, TRF2 y POT1, las cuales se han considerado como factores importantes en la estabilización de la longitud telomérica.

Lo anterior permitirá extender esta línea de investigación en Genética Molecular del Telómero para desarrollar proyectos relacionados en otros tipos de cáncer.