Reacción en Cadena por la Polimerasa (PCR)

Guillermo Gómez Jurado.
Profesor Universidad de La Salle

Para algunos colegas, en especial los que se encuentran trabajando con técnicas de laboratorio esta prueba es suficientemente conocida, pero reiteramos que el principal objetivo de nuestra columna Sabe o Recuerda, es el de llevar nuevas informaciones a otros profesionales que no tienen acceso a informaciones científicas, ni la oportunidad de encontrarse vinculados a publicaciones técnicas.

Durante los últimos años se han realizado notables avances en el perfeccionamiento de las técnicas moleculares aplicables en las áreas de inmunología, diagnóstico y genética. La técnica de Reacción en cadena por la Polimerasa (PCR), ideada por K. Mullis en 1983, perfeccionada por Saiki (1985), White y Erlich en 1989, tiene grande importancia y ventajas en el diagnóstico de varias enfermedades virales como New Castle, Gumboro, Bronquitis, por protozoarios como Leishmania, Trypanosoma, Plasmodium y bacterianas como salmonellosis, mycoplasmosis, colibacilosis, tuberculosis, cólera, caracterizándose por ser una prueba de alta especificidad y sensibilidad en la detección de microorganismos patógenos.

La reacción de PCR consiste en el reconocimiento y la amplificación repetitiva de una fracción del Acido Desoxiribonucleico (ADN) utilizando sondas de nucleótidos. Estas sondas ya hibridizadas al ADN que se estudia, servirán como matrices en la producción de otras cadenas de ADN mediante la acción de una enzima la Polimerasa.

Una muestra que contenga el Acido Ribonucleico (ARN) de un virus se puede detectar mediante el PCR con la condición que el ARN sea transformado a un ADN para que la enzima pueda actuar. El resultado de la reacción se observa utilizando un proceso de electroforesis en gel de agarosa.

Básicamente la ejecución de la prueba se realiza usando una mezcla que contenga el ADN para amplificar y los componentes que se requieren para formar nuevas cadenas de ADN, un ciclador térmico para realizar los cambios de temperatura y ciclos de amplificación. Los elementos fundamentales para la realización de la prueba son:

A. La muestra que contiene el ADN
B. el medio líquido tampon donde se produce la reacción que consta de Tris-acido clorhídrico, cloruro de potasio y cloruro de magnesio.
C. Deoxidonucleotidos trifosfato que se utilizan como eslabones para la producción de cadenas nuevas de ADN.
D. Una enzima Polimerasa con capacidad de termorresistencia como la Amplitaq y que tiene la propiedad de incorporar muchos nucleótidos al ADN.
E. Sondas de nucleotidos que se diseñan con base a secuencias de porciones del ADN que van a confirmar el genoma de un organismo determinado.

Todos estos componentes se mezclan en tubos de poliestireno y se someten a las temperaturas indicadas para la amplificación del ácido nucleico que se realizan en un ciclador térmico.

Primero se desnaturalizan y separan las cadenas complementarias del ADN, calentando la muestra a temperaturas de 94o a 98 o C durante 2 a 4 minutos, después se realiza la adhesión de las sondas a las cadenas complementarias del ADN a unas temperaturas entre los 37o a los 65oC con duración de 30 segundos a 2 minutos. Luego se extienden las sondas con la acción de la polimerasa a una temperatura de 72o a 75oC. Estos ciclos deben repetirse de 25 a 35 veces para lograr la amplificación matemática del ADN. Una vez obtenida la amplificación del ADN se pasa por un equipo de electroforesis que contiene un gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio para exponerlo a radiación U.V.

Para que la prueba sea ejecutada correctamente se necesitan los siguientes parámetros: un balance perfecto de los componentes de la mezcla, el uso de adecuadas sondas de nucleotidos, una eficiente temperatura de templado y la cantidad exacta de la enzima polimerasa.

Una de las ventajas del PCR es la detección rápida y específica de los ácidos nucleicos de microorganismos patógenos en una muestra problema, con la característica de tener una alta especificidad y sensibilidad. La prueba permite una obtención rápida de resultados y se pueden examinar varias muestras en corto tiempo.