Ciencias Básicas: Cámaras de Silicona como Injerto Nervioso

Análisis de la Especificidad de Regeneración del Nervio Peroneal O Tibial. Estudio Experimental en Ratas

Dr. Carlos Hernán Méndez Daza*, Dra. Yolanda Restrepo Rengifo**, Dr. John Jairo Sutachan Rubio***
Dr. Luis Hidelbrando Alzate****, Dr. Hernán Hurtado*****
* Especialista en Ortopedia y Traumatología, Universidad Nacional.
** Profesor Titular Unidad de Ortopedia y Traumatología, Universidad Nacional.
*** Investigador Instituto Nacional de Salud.
**** Médico Cirujano, Universidad de Caldas.
***** Biólogo, PhD, Coordinador Departamento de Neurociencias, Instituto Nacional de Salud.

Resumen

En el presente estudio se creó un modelo experimental en el cual, el nervio ciático de 30 ratas adultas fue seccionado y posteriormente suturado a un tubo de silicona. A los tres y seis meses de regeneración la rama peroneal o tibial fue seccionada proximal al tubo. Se esperó la degeneración Walleriana y luego se tomaron tres niveles para los estudios histológicos e inmunohistoquímicos: la parte media de la cámara y los nervios del peroneal y tibial distales. Se contaron las fibras y se analizó la contribución específica de cada nervio en el extremo distal. Los datos se analizaron tomando como variables la contribución y distribución de las fibras. En este trabajo se logró demostrar una regeneración inespecífica en el extremo distal, encontrándose fibras provenientes de cualquiera de los dos nervios.

Palabras clave: cámaras, especificidad, regeneración nerviosa.

Introducción

La regeneración funcional después de una sección nerviosa es un proceso complejo que depende de factores centrales, locales y periféricos. La sección de un nervio periférico altera tanto la estructura del tronco nervioso como el microcompartamiento endoneural. Numerosos factores influyen en la regeneración de los nervios periféricos, contribuyendo al éxito o al fracaso de la reparación. Los mecanismos básicos del control de la mielinización de las fibras regeneradoras están parcialmente determinados, pero continúan siendo poco conocidos los procesos del crecimiento y orientación de las fibras.

Cuando existe una brecha entre los dos extremos nerviosos es claro que las estructuras que guían el proceso axonal pueden producir neuronas, errores en la dirección de las fibras o bloqueo en el paso de las mismas. Lundborg ha estudiado diferentes modelos experimentales para analizar la regeneración neuronal in vivo; en estos trabajos los extremos proximales y distales del nervio seccionado son suturados a un tubo de silicona, logrando probar que los axones del extremo proximal alcanzan el muñón distal1.

Otros trabajos han utilizado materiales tales como, cámaras permeables2, reabsorbibles3, tejido nervioso proveniente del perineurio4, o endoneurio5.

En todas estas cámaras se ha encontrado crecimiento axonal, pero hay controversia en cuanto a la especificidad de regeneración, es decir, que la orientación de la fibras provenientes de un tronco nervioso se efectúe de manera estricta a la rama terminal correspondiente. Madison6, Danielsson7 y Butí8

informan diferencias en cuanto a la especificidad de regeneración de acuerdo con el sitio de implantación de la cámara.

Posterior a la sección axonal suceden una serie de cambios en la parte proximal9, 10, 11, 12, 13 y distal14 que han sido conocidos bajo el nombre de degeneración Walleriana15, 16, 17. Esta es una respuesta celular que depende de los fibroblastos, células endoteliales, macrófogos y mastocitos18, correspondiendo la mayor parte de la degeneración Walleriana a los macrófogos, que son los encargados casi totalmente de la fagocotosis19.

El nervio periférico es rico en neurofilamento20, proteína21 que constituye el principal componente del citoesqueleto axonal, formado por tres polipéptidos con pesos moleculares diferentes22. Posterior a la sección del nervio existe una gran disminución de esta proteína (NF), presentándose cambios muy importantes en las subunidades polipeptídicas, lo cual se traduce en la destrucción del nuerofilamento23, 24.

En el presente estudio el modelo experimental creado consiste en el uso de una cámara de silicona como injerto nervioso en el ciático de la rata. Después de tres o seis meses de regeneración se efectúa la sección del nervio tibial o peroneal proximal al tubo para estudiar con métodos histológicos e inmunohistoquímicos, la especificidad de regeneración de estos nervios a nivel distal.

Materiales y métodos

30 ratas adultas, machos y hembras, de la cepa Wistar con peso promedio entre 225 y 300 gramos fueron utilizadas en este trabajo. El nervio ciático derecho de cada animal fue intervenido quirúrgicamente utilizando un tubo de silicona como injerto nervioso. Se dividieron en dos grupos de acuerdo al tiempo de regeneración: 3 y 6 meses, denominados grupo I y grupo II,

respectivamente. En el grupo I, 5 animales se dejaron como control y en 10 se lesionó el nervio peroneal proximal a la cámara. En el grupo II, 5 fueron dejados como control y los restantes se dividieron en dos: en 5 se seccionó el nervio tibial y en 5 el nervio peroneal proximal a la cámara.

Técnica quirúrgica

Los animales fueron anestesiados con 0,2ml de atropina y pasados 10 minutos se utilizó la mezcla de ketamina (90mg/kg.) y xilazina (15mg/kg.) vía intraperitoneal. Una cámara impermeable de silicona, de 8mm de longitud y 1.1mm de diámetro interno que utilizada como conducto nervioso sintético. Después de disecar el nervio ciático, éste fue seccionado. Los extremos nerviosos proximal y distal fueron introducidos 2mm en cada lado de tubo y fijados en su posición por sutura nylon 9-0, dejando una brecha de 4mm al interior de la cámara que fue verificada bajo el microscopio quirúrgico. Distalmente es posible observar la división macróscopica del nervio en sus tres ramas principales: peroneal, tibial y sural. La piel fue suturada y los animales llevados a recuperación con lámpara de calor radiante. Posteriormente fueron guardados en jaulas del bioterio del Instituto Nacional de Salud (INAS), que cumple con las normas internacionales de cuidados animales. Se les suministró acetaminofén en suspensión en el agua de los bebedores para proveer analgesia durante 1 semana.

A los tres meses 10 animales del grupo I, fueron anestesiados nuevamente, se identificó el nervio peroneal proximal a la cámara y se seccionó. A los 6 meses, 10 animales del grupo II, fueron intervenidos para seccionar en 5 de ellos el nervio peroneal y en los dos restantes el nervio tibial, siguiendo el mismo procedimiento. Pasados 8 días de la segunda intervención se sacrificaron los animales en conjunto con los controles para cada grupo en los tiempos previamente determinados. Esta sección

se efectuó para que el nervio sufriera una degeneración Walleriana anterógrada y de esta manera identificar y diferenciar en la histología las fibras regeneradas de la degeneradas.

De acuerdo con los estudios de Sunderland25, 24 horas después de la sección del nervio se evidencian cambios a nivel del axón, los cuales se manifiestan por un edema inicial seguido por la fragmentación del neurofilamento y la aparición de irregularidades en el contorno, con separación de la vaina de mielina. Esta es la razón por la cual, la técnica con inmunohistoquímica sólo detecta las fibras regeneradas normales después de la lesión proximal a la cámara de los nervios en los grupos experimentales.

Los animales fueron sacrificados, luego son perfundidos con solución fijadora (Karnovsky) y después para realizar los estudios histológicos se tomaron los nervios a tres niveles: cámara, nervios tibial y peroneal distales. Estos segmentos nerviosos fueron separados y preparados en resina. Posteriormente se realizaron cortes a una micra y fueron sometidos a las técnicas de histología convencional (Azul de Toluidina) e inmunohistoquímica mediante una reacción indirecta utilizando el sistema ABC (Avidin-Biotin-Complex), peroxidasa y la DAB (3.3 Diamino-benzidina-Tetrahidrocloridrato) como cromógeno para la identificación de fibras normales26.

Análisis de los hallazgos

Los cortes efectuados en los tres niveles: cámara, peroneal y tibial, fueron descritos desde el punto de vista histológico. Las fibras fueron cuantificadas en la totalidad de cada lámina y se comparó el promedio de fibras de la cámara con los promedios de los nervios distales (tibial y peroneal).