Técnica de Sacrificio: Reconstrucción de Ligamento Cruzado Anterior en Esqueleto Inmaduro

Para el sacrificio, se aplicó por vía intravenosa una sobredosis de Rompun más Pentobarbital, ocasionando paro respiratorio inmediato a todos los animales. Se sacrificaron perros de cada grupo de la siguiente manera: a las seis semanas 4 perros de reconstrucción con túneles (grupo túnel 6) y 4 perros de la técnica “sobre el cóndilo”, conocida en la literatura inglesa como “under and over” o “over the top” (OTT) (grupo OTT 6).

A las 12 semanas se sacrificaron 4 perros de recons-trucción con túneles (grupo túnel 12) y 4 de reconstrucción con técnica “sobre el cóndilo” (grupo OTT 12). Estos 16 perros sacrificados se utilizaron para el estudio anatomopatológico e histológico.

En los perros sacrificados las extremidades posteriores fueron entonces disecadas y extraídas para hacer una medición de longitud real de ambos fémures y tibias. La longitud del fémur fue tomada desde el borde superior de la cabeza femoral hasta el borde más distal del cóndilo femoral interno.

La longitud de la tibia fue tomada desde el punto más proximal del platillo tibial interno hasta el punto más distal del maleolo tibial. Para esta medición se utilizó una regla de precisión en milímetros con sus décimas.

Técnica de preparación histológica

Cada extremidad posterior fue disecada hasta obtener el extremo proximal de la tibia y el distal del fémur, libres de tejidos blandos. En las tibias con túnel transepifisiario se realizaron cortes coronales cada dos milímetros, hasta establecer el punto central de dicho túnel, sitio en el cual su espesor fue mayor. A partir de este corte se realizaron 4 cortes hacia anterior y 4 hacia posterior, cada 6 micras.

En las tibias con la técnica “sobre el cóndilo”, al igual que en todos los controles, se realizó un corte coronal en un sitio equivalente al correspondiente al centro del túnel tibial y los cortes anteriores y posteriores a este punto de la misma forma. No se utilizaron para el análisis histológico los fémures, ya que la forma ondulada, irregular de su fisis hace que sea poco fiable la toma de medidas histomorfométri-cas con puntos de medición similares en todos los cortes.

Se realizó una medida histomorfométrica cuantitativa del tamaño de la fisis en todas las rodillas intervenidas con ambas técnicas y sus controles contralatarales para su comparación estadística. En estas rodillas control contralate-rales se realizaron los mismos cortes para determinar el tamaño relativo de la fisis.

También se realizó una medida histomorfométrica cuantitativa del área de pérdida del patrón fisiario alrededor del túnel transepifisiario, para ser comparada a las 6 y 12 semanas. Finalmente se realizó un análisis cualitativo determinando la presencia de puentes óseos en las tibias operadas con la técnica de túneles.

Análisis cuantitativo histomorfométrico

Tamaño de la fisis

Inicialmente se estableció el centro del túnel transfisiario, tomando el mayor diámetro del ligamento a través de este túnel. A partir de este punto, se realizaron 4 cortes hacia anterior y 4 cortes hacia posterior a una distancia de 6 micras (Figura 1). Se utilizaron únicamente las tibias para medir el tamaño de la fisis como parámetro de lesión fisiaria.

En las tibias control y en las operadas con la técnica “sobre el cóndilo”, se tomó un punto similar a las tibias con túneles, para los cortes. En los 8 cortes por tibia descritos anteriormente, se ubicó el punto central de la fisis en su longitud de interno a externo. A partir de este punto y bajo visión directa sobre el portaobjeto se tomaron dos puntos de medición a 5 mm: uno externo y otro interno.

En total se realizó la medición en un punto central y dos laterales. Cabe anotar que por lo general, el punto central coincidió con el área más cercana al túnel. Los 3 puntos descritos, fueron tomados como puntos de medición del tamaño fisiario (Figura 2). El tamaño de la fisis se tomó entre el borde epifisiario de la capa germinativa y el borde metafisiario de la capa hipertrófica.

(Foto 1) Se tomó el valor promedio del punto interno y externo para ser comparados entre sí, a las 6 y 12 semanas y con los valores en sitios similares de la tibia contralateral. No se utilizó el punto central para el tamaño promedio de la fisis ya que está muy alterado, y es de difícil medición en las tibias con túneles transfisiarios. La misma medi-ción se realizó en los cortes de las tibias operadas con la técnica “sobre el cóndilo” y sus controles.

Los valores promedio de tamaño fisiario en los puntos externo e interno fueron comparados entre sí, con el fin de determinar un posible crecimiento irregular de la fisis. Este crecimiento irregular podría ser un predictor histológico de una deformidad angular.

Los valores de esta variable son expresados en milímetros y sus décimas, ya que se utilizó para la medición un microscopio con proyección sobre una superficie plana con cuadrícula milimetrada, a una distancia establecida en 50 cm. La medida fue corroboradasobre la superficie de proyección con un medidor de exactitud, grafículo de Merz.

Fig. 1 A la izquierda se observa el esquema de la imagen del túnel tibial desde su aspecto superior-proximal. A partir del centro del túnel, se realizan 4 cortes hacia posterior y 4 cortes hacia anterior. La imagen coronal de cada sorte, se observa a la derecha.

Fig. 2 En cada corte coronal se toma el punto central de la fisis utilizando una regla milimétrica. A partir de este punto se determinan 2 puntos: uno extremo y otro interno, a 5 mm del punto central.

Foto 1 Puntos de referencia para la medición del tamaño de las fisis. Entre el borde epifisiario de la capa germinativa (G) y el borde metafisiario de la capa hipertrofica (H) de la fisis proximal de la tibia.

Área de pérdida del patrón fisiario

Esta medición sólo se realizó en las tibias operadas con túneles transfisiarios. Se tomó la medida desde el borde interno del túnel hasta el punto inicial de regularización de la fisis (véase Foto 2). Esta medición se realizó tanto en el borde externo del túnel como en el interno. Para esta medición se utilizó el lente x10 de un microscopio de luz (Olympus).

Se ubicó el borde del campo en los puntos a medir y se midió su desplazamiento en milímetros y sus décimas, según el sistema de medición adjunto al portaobjetos, incluido en el microscopio. Se consideró esta área medida, como área de pérdida del patrón fisiario. Dicha medición se realizó en el área fisiaria externa e interna al túnel en todos los cortes de tibias con reconstrucción transfisiaria del LCA.

Se tomó un promedio de la distancia encontrada en el área fisiaria externa y un promedio de la distancia encontrada en el área fisiaria interna. Dichos valores fueron comparados para establecer la pérdida del patrón fisiario externa e interna al túnel. Igualmente se compararon los valores promedio de dichas áreas a las 6 y 12 semanas para establecer la evolución de la pérdida del patrón fisiario como parámetro de lesión fisiaria.

Esta variable de pérdida del patrón fisiario sólo se evaluó en la tibia, ya que la forma de la fisis femoral hace imposible la adecuada ubicación geométrica del túnel transepifisiario.

Foto 2 El área de pérdida del patrón fisiario (APPF) se midio a partir de una línea en el borde de la fisis (F) con el túnel (T), y su distancia en milímetros hasta una línea que pasa por el sitio de regularización de las capas de fisis.

Análisis cualitativo de puentes óseos transfisiarios

Se tomaron las tibias con túneles transfisiarios y se observó la presencia de puentes óseos en el borde externo e interno de dicho túnel, a nivel de la fisis. La presencia de células óseas fue medida en términos de extensión de las mismas a través del tercio proximal, medio o distal del túnel, en el sitio donde éste atraviesa la fisis. Se compararon estos hallazgos a las 6 y 12 semanas. Para esta medición se utilizó el lente x 10 de un microscopio de luz (Olympus).

El análisis estadístico se realizó mediante un estudio pareado tipo Student-T, determinando inicialmente la estadística descriptiva de cada grupo con sus respectivas desviaciones estándar. Una vez obtenido el valor de cada una de las variables, se realizó un ANOVA de dos vías, analizando cada parámetro en comparación con su control contralateral.

Para evitar sesgos por variaciones biológicas entre los diferentes especímenes, se realizó un ANOVA de mediciones repetitivas, así como un análisis de valores normalizados en el que se compararon las diferencias de las variables respecto de su control contralateral. De esta manera se aseguró un control de alta potencia estadística y se redujo el número de especímenes necesarios para un análisis adecuado.

Tanto los reportes de la literatura como nuestros propios estudios pilotos determinaron que la posibilidad de resultados adecuados con el autoinjerto de LCA era cercana al 80%, por lo que se realizó un análisis de potencia obteniendo un mínimo de tres especímenes por grupo. Estos análisis se realizaron comparando los dos grupos de estudio en los dos puntos de análisis presentados en materiales.

El análisis histomorfométrico y los cambios macroscópicos (longitud), fueron analizados en forma ciega por los mismos observadores y coautores de el trabajo. El análisis final de los datos se realizó con la ayuda del Laboratorio de Investigación en Ortopedia del Postgrado de Cirugía Ortopédica y Traumatología de la Universidad El Bosque, y con la utilización del programa estadístico Stat-View 4.1.

Resultados

Tamaño de la fisis

Se tomaron los valores promedio del tamaño de la fisis en los dos puntos de medición: externo e interno, tanto en las rodillas operadas como en sus controles, a la 6a y 12a semanas.

A las 6 semanas se comparó el tamaño promedio de la fisis en el punto externo e interno en las tibias operadas y sus controles. Al comparar el tamaño promedio en el punto externo de las fisis en las tibias con túneles transfisiarios (20.09 mm), con el mismo punto de medición en las tibias operadas con la técnica “sobre el cóndilo” (18.36 mm), no encontramos una diferencia significativa (p = 0.42).

Igual comportamiento tuvo la comparación de la medición del tamaño fisiario en el punto interno. El tamaño promedio de este punto en las tibias con túneles transfisiarios (19.57 mm), no tuvo una diferencia significativa con el mismo punto de medición en las tibias operadas con la técnica “sobre el cóndilo” (15.71 mm), (p = 0.07). (Gráfica 1).

El tamaño promedio de la fisis en los dos puntos de medición a las seis semanas en las tibias operadas no tuvo diferencias significativas con sus controles, tanto en el grupo de tibias tunelizadas como en las operadas con la técnica “sobre el cóndilo”. La comparación del tamaño promedio de la fisis en los dos puntos de medición fisiario entre los controles de los dos grupos de estudio, tampoco tuvo una diferencia significativa (Gráfica 1).

A las 12 semanas se comparó el tamaño promedio de la fisis en los puntos externo e interno en las tibias operadas y sus controles. El tamaño promedio de la fisis en el punto externo de las tibias con túneles transfisiarios (10.86 mm), fue significativamente menor que el mismo punto de medición en las tibias operadas con la técnica “sobre el cóndilo” (12.85 mm) (p = 0.01).

El tamaño promedio de la fisis en el punto interno de las tibias operadas con túneles transfisiarios (12.55 mm), no tuvo una diferencia significativa con el mismo punto de medición en las tibias operadas con la técnica “sobre el cóndilo” (13.04 mm) (p = 0.55) (Gráfica 2).

El tamaño promedio de las fisis en los dos puntos de medición en las rodillas operadas fue similar a sus controles, tanto en el grupo de tibias tunelizadas como en las operadas con la técnica ¨sobre el cóndilo¨ La comparación del tamaño promedio de la fisis en los dos puntos de medición entre los controles de ambos grupos de estudio, tampoco tuvo una diferencia significativa. (Gráfica2).

Gráfica 1. El tamaño promedio de la fisis en el punto externo a las 6 semanas, en las tibias con túneles transfisiarios (Tibias túnel, columna punteada), no tuvo una diferencia significativa con el mismo punto de medición en las tibias de la técnica ¨sobre el cóndilo¨ (Tibias OTT, columna punteada) (p=0.42). El tamaño promedio de la fisis en el punto interno de las tibias con túneles transfisiarios (Tibias túnel, columna blanca), tampoco tuvo una diferencia significativa con el mismo punto de medición en las tibias con la técnica ¨sobre el cóndilo )Tibias OTT, columna blanca) (p=0.07).

El tamaño de la fisis en los dos puntos de medición en las tibias operadas no tuvo diferencias significativas con sus controles, tanto en el grupo de tibias tunelizadas (Tibias Túnel vs Tibias Control OTT). La comparación del tamaño de fisis en los dos puntos de medición fisiaria de los controles de ambos grupos de estudio, tampoco tuvo una diferencia significativa (Tibias Control Túnel vs Tibias Control OTT ).

Gráfica 1
Tamaño promedio de la Fisis a la 6a semana.

Gráfica 2. El tamaño promedio de la fisis a las 12 semanas, en el punto externo de la stibias tunelizadas ( Tibias Túnel, columna punteada), fue significativamente menor que el mismo punto de medición en las tibias operadas con la técnica ¨sobre el cóndilo¨( Tibias OTT, columnas punteada) (P=0.01): El tamaño promedio de la fisis en el punto interno de las tibias operadas con túneles transfisiarios (Tibias Túnel, columna blanca), no tuvo una diferencia significativa co el mismo punto de medición en las tibias operadas con la técnica ¨sobre el cóndilo¨ ( Tibias OTT, columna blanca) ( p=0.55).

El tmaño promedio de la fisis en los dos puntos de medición en las tibias operadas no tuvo diferencias significativas con sus controles, tanto en el grupo de tibias tunelizadas ) Tibias Túnel vs Tibias Control Túnel) como en las operadas con la écnica ¨sobre el cóndilo¨(Tibias OTT vs Tibias Control OTT). L a comparación del tamaño promedio de la fisis en los dos puntos de medición fisisario de los controles de los dos grupos de estudio, tampoco tuvo una diferencia signficativa (Tibias Control Túnel VS Tibias Control OTT).

Gráfica 2
Tamaño promedio de la fisis a la 12a. Semana

La comparación del tamaño de la fisis en los dos puntos de medición entre la 6a y 12a semana, mostró una reducción significativa tanro en las tibias operadas con las dos técnicas como en sus controles. Lo anterior indica la evolución normal del tamaño de la fisis con el crecimiento óseo.

Al sumar los valores promedio del tamaño fisiario en los puntos interno y externo, obtuvieron el tamaño promedio de la fisis. Este valor promedio de tamaño fisisario se tomó a la 6a y 12a semanas, tanto en las tibias operadas como en sus controles. Al restar el valor promedio de tamaño fisiario a la 12a semana, de mismo valor a la 6a semana, obtuvimos el valor de reducción del tamaño fisisario entre la 6a y 12a semanas.

El valor de reducción del tamaño fisiario en las tibias operadas con la técnica de túneles (8.12mm) fue 31% mayor que el valor de reducción en sus tibias control(5.61mm), y esta diferencia fue significativa(p=0.03). El valor de reducción del tamaño fisiario en las tibias operadas con la técnica ¨sobre el cóndilo¨fue 23% menor que el valor de reducción en sus tibias control(4.47mm), y esta diferencia fue significativa(9=0.0.2). (Gráfica 3).

El valor de reducción del tamaño fisiario en las tibias operadas con la tecnica de tuneles fue 57% mayor que el valor de reducción en las tibias operadas con la técnica ¨sobre cóndilo¨, y esta diferencia fue significativa( p=0.45). (Gráfica3).

Gráfica 3. Comparación del valor de reducción del tamaño fisiario entre las tibias operadas y sus controles. En las tibias operadas con la técnica de túneles (Columna punteada izquierda) fue 31% mayor que en sus controles (Columna blanca izquierda) (p=0.03). En las tibias operadas con la técnica “sobre el cóndilo” (Columna punteada derecha) fue 23% menor que en sus controles (Columna blanca derecha) (p=0.02).

La reducción en el tamaño fisiario de las tibias operadas con la técnica de túneles (Columna punteada izquierda) fue 57% mayor que en las tibias operadas con la técnica ¨sobre el cóndilo¨ ( columna punteada derecha ) (p=0.03). No hubo diferencia significativa al comparar este valor de reducción entre los controles de los dos grupos de estudio(p=0.45).

Gráfica 3
Valor de la reducción del tamaño fisiario entre la 6a y 12a semanas

Comparación del cierre fisiario en los puntos externo e interno de medición del tamaño fisiario, entre la 6a y 12a semanas

Para establecer la simetría en el cierre de la fisis entre el punto externo e interno, se compararon los valores promedio de cada uno de estos dos puntos entre la 6a y 12a semanas. La diferencia entre dichos valores, es la magnitud del cierre de la fisis en el punto externo e interno. Este valor se comparó en las rodillas operadas y sus controles.

La magnitud del cierre fisiario en el punto externo (9.23 mm) de las rodillas operadas con túneles transfisiarios fue 24% mayor que en el punto interno (7.02 mm), y esta diferencia fue significativa (p=0.03). Igualmente, la magnitud del cierre fisiario en el punto externo (5.51 mm) de las rodillas operadas con la técnica “sobre el cóndilo” fue 48% mayor que en el punto interno (2.67 mm), y esta diferencia fue significativa (p=0.01).

La magnitud del cierre fisiario en el punto externo (4.73 mm) de las tibias control de las tunelizadas fue similar al cierre fisiario en el punto interno (6.49 mm), sin encontrarse diferencia significativa (p=0.20). Igual sucedió con las tibias control de la técnica “sobre el cóndilo”, donde el cierre en el punto externo (7.49 mm) fue muy similar al del punto interno (6.49 mm), sin encontrarse una diferencia significativa (p=0.49) (Gráfica 4).

Gráfica 4. La magnitud del cierre fisiario en el punto externo fue mayor que en el interno, en las tibias con la técnica de túnel(p=0.003), al igual que la diferencia entre estos dos puntos en las Tibias con la técnica OTT (¨sobre el cóndilo¨) (p=0.01). Las diferencias en el cierre fisiario al comparar el punto externo e interno en las tibias control de los dos grupos de estudio, no fueron estadísticamente significativas.

Gráfica 4
Comparación de la magnitud del cierre fisiario en los puntos externo e interno entre la 6a y 12a semanas