Producción de proteínas recombinantes

La Ingeniería Genética ha abierto la posibilidad de emplear bacterias y otros microorganismos para producir proteínas de importancia económica, médica e industrial. Esto ha posibilitado el desarrollo una de las más nuevas fronteras de conocimiento en la genética y la biología molecular.

Una proteína recombinante es aquellas que se expresa como parte de un construido generado por clonación molecular en un sistema biológico. Generalmente estas proteínas se expresan en sistemas biológicos en los que naturalmente no existe su síntesis, por lo que es una información genética nueva que se expresa empleando la maquinaria biosintética de la célula que contiene el construido. La producción de proteínas recombinantes ha abierto una gran frontera para la obtención de organismos biofábricas que sintetizan proteínas recombinantes de interés biotecnológico. Recientemente se ha documentado la clonación de genes de proteínas de importancia médica como la insulina, la somatostatina y la eritropoyetina, entre otros, lo que ha permitido el inicio de una nueva era de la industria farmacéutica en la que los fármacos, proteínas recombinantes, se producen por sistemas de crecimiento de organismos biofábrica.

Con esta visión la industria farmacéutica actual ve la importancia de implementar procesos menos contaminantes y con costos de producción menores. Además uno de los problemas más importantes de la agricultura moderna, es el empleo de insecticidas y controladores de plagas, pues la utilización de estos compuestos además de incrementar costos de producción también aumenta el peligro de contaminación del ecosistema y por ende trae consecuencias importantes para la salud humana. Una de las alternativas viables para resolver esta problemática es la introducción de genes de fijación de nitrógeno y otros genes como los de resistencia en bacterias que habiten en las raíces de plantas no leguminosas con lo que se eliminaría el uso de fertilizantes nitrogenados o de pesticidas y controladores de plagas. Uno de los elementos centrales en la implementación de los procesos biotecnológicos antes mencionados, es el desarrollo de sistemas de expresión modulada de genes, los denominados vectores de expresión.

Tal como habíamos descrito en secciones anteriores, lo vectores de expresión son un aspecto fundamental para la producción de proteínas recombinantes. De acuerdo con lo que se muestra en la tabla 2 existen varios elementos genéticos que hacen parte de este grupo de los vectores de expresión tanto en los sistemas procarióticos como el los eucarióticos. Estos son requisitos mínimos que debe tener un vector de expresión. En general las funciones algunos de ellos son similares, lo que cambia es su capacidad para expresar la proteína recombinante en un huésped procariótico (bacteria) o en uno eucariótico (células en cultivo).

El uso de productos recombinantes tiene ventajas importantes en comparación con el empleo de material extraído de tejidos, especialmente en lo que se refiere a proteínas humanas. Con frecuencia la fermentación de bacterias en biorreactores produce cantidades importantes de proteína a bajos costos y con relativa pureza. Se obvian pasos en la síntesis química o en la extracción que utilizan reactivos potencialmente nocivos para la salud. Este aspecto es fundamental en el control de calidad, el cual es más fácil y seguro para la producción de un agente terapéutico vía DNA recombinante.

Hasta el momento, la clonación de muchos genes eucarióticos en vectores de expresión bacteriana ha traído problemas tecnológicos pues las proteínas recombinantes producidas no parecen expresarse en forma correcta. Este hecho ha impulsado la construcción y desarrollo de nuevos vectores de expresión que contienen promotores de origen eucariótico presentes en virus animales o en genes humanos aislados previamente. Con la utilización de vectores de expresión eucarióticos ha sido posible la expresión y producción comercial de la Insulina humana recombinante y de la Somatostatina humana de origen recombinante entre muchas de las proteínas recombinantes utilizadas actualmente en el tratamiento de enfermedades humanas. La tabla 3 consigna las características de algunas proteínas que se emplean hoy como agentes terapéuticos. Muchos de ellos ya se encuentran en fase de producción comercial mediante la clonación molecular y su expresión, a gran escala.

Tabla 2. Características de los vectores de expresión tanto procarióticos como eucarióticos

Tabla 3. Proteínas terapéuticas usadas hoy en día en la clínica y producidas vía DNA recombinante.

Nuestros conocimientos moleculares sobre las enfermedades hereditarias son mucho más recientes. En estas el defecto genético ocasiona la función anormal de una proteína específica. Con todo el incremento en las investigaciones que ha ocurrido en los últimos veinte años, ha sido posible el entendimiento al nivel molecular de muchas enfermedades, incluyendo las no genéticas. En este sentido la caracterización de ciertas proteínas que aparentemente faltan o no funcionan correctamente, ha abierto el camino para una potencial estrategia terapéutica en el tratamiento de algunas enfermedades en las que estas proteínas juegan un papel importante.

Las nuevas vacunas

En todo el mundo, desde principios de la década de 1980, laboratorios y científicos investigan el desarrollo de nuevas vacunas que se espera, reemplazarán en un futuro a las tradicionales actualmente empleadas. Estas nuevas vacunas son producidas por la Ingeniería Genética, basadas en la molécula de DNA y en las secuencias de aminoácidos que contienen la información genética con la cual el organismo patógeno produce la enfermedad. La primera vacuna recombinante para uso en humanos fue la vacuna contra la hepatitis B. Actualmente, las investigaciones se centran en mejorar las vacunas ya existentes para lograr respuestas inmunitarias más eficaces, nuevas vías de administración y en la aplicación de vacunas combinadas (varias vacunas en una sola dosis) para reducir el número de inyecciones. El descubrimiento y decodificación de los genomas de bacterias y virus patógeno llevado a cabo en los últimos años, ha abierto una enorme esperanza en el desarrollo de estas nuevas vacunas. Actualmente existen una gama de protocolos para obtener vacunas. Así las vacunas con base en la técnica del DNA pueden incluirse en una de las siguientes estrategias:

Vacunas atenuadas: mediante técnicas de Ingeniería Genética, se pueden eliminar los genes de virulencia de un agente infecciosomanteniendo la habilidad de provocar una respuesta inmune. En este caso, el organismo modificado genéticamente puede usarse como una vacuna viva sin riesgo a que revierta al tipo virulento. En la actualidad, se encuentra en fase de ensayos clínicos una vacuna de cepas estables del agente del cólera (Vibrio cholerae). El mismo, está desprovisto del gen que codifica para su potente enterotoxina que provoca la enfermedad. En el caso de Salmonella se ha ensayado quitarle ciertos genes que aunque no están relacionados con la virulencia, al desaparecer convierten la cepa en atenuada (disminución de su virulencia en un millón de veces). Se ha demostrado su efectividad en ovejas, bovinos, pollos y, más recientemente en humanos.

Vacunas vectores o de organismos recombinantes vivos: estas, utilizan microorganismos no patógenos (virus o bacterias) a los cuales se les incorporaron, mediante Ingeniería Genética, genes de agentes patógenos que codifican para los antígenos que desencadenan la respuesta inmune. El virus vacunal es uno de los vectores recombinantes más utilizados en este tipo de vacunas, ya que tiene un genoma grande, totalmente secuenciado y permite acomodar varios genes foráneos en su interior. De esta manera, se ha desarrollado una vacuna contra la rabia al insertar en el genoma de este virus, un gen del virus rábico; este construido provoca la respuesta inmune en el organismo hospedador. También se han ensayado las expresiones de genes que codifican para antígenos de virus de la hepatitis B, de la gripe y del herpes simple. Mediante este método, se podrían desarrollar vacunas que inmunicen simultáneamente para varias enfermedades, al insertar en el virus recombinante varios genes de distintos organismos patógenos al mismo tiempo.

Virus vivos recombinantes: los Paramyxovirus son una familia de virus que incluye agentes de enfermedad comunes como sarampión, paperas y para influenza. La estructura genómica de estos virus es tal, que se le podrían insertar genes adicionales que codificasen una amplia variedad de proteínas de fuentes diferentes. Así el virus del sarampión ofrece varias ventajas como portador de genes que provoquen respuesta inmune contra otras enfermedades al mismo tiempo. Con tecnologías recombinantes se hace posible extender el rango de enfermedades contra las que una sola cepa atenuada del virus puede conferir inmunidad.

Vacunas de subunidades: para aquellos agentes infecciosos que no se pueden mantener en cultivo, es posible aislar los genes que codifican para las proteínas que provocan la respuesta inmune (por ejemplo, las proteínas de las cápsides). Mediante Ingeniería Genética, esos genes se pueden clonar y expresar en huéspedes alternativos tales como bacterias (Escherichia coli), levaduras (Saccharomyces cerevisiae) o líneas celulares de mamíferos. Luego de insertado el gen de interés, la bacteria o levadura recombinante comienza a producir subunidades de proteínas en grandes cantidades, las cuales son recolectadas y purificadas para utilizarlas como vacunas. La vacuna contra la hepatitis B fue la primera vacuna puesta en el mercado producida por este método. Esta vacuna se desarrolló aislando el gen del virus que codifica para el antígeno HBsAg que provoca respuesta inmune. El gen que produce esta proteína se introdujo por clonación en plásmidos de expresión de levaduras (S. cerevisiae). Una vez construido, el antígeno se produjeron en grandes volúmenes en fermentadores industriales y de un modo seguro. En la actualidad, se está avanzando en vacunas de subunidades frente al virus del herpes simple (HSV), y la fiebre aftosa.

Vacunas de DNA: son las vacunas actualmente en experimental que suscitan mucha expectativa. Estas consisten en plásmidos en los que se introduce tan solo la pequeña fracción del material genético del patógeno contra el que se pretende inmunizar (los genes que codifican la producción de uno o varios de sus antígenos). Cuando se inyecta el plásmido en el músculo o en la piel, este penetra dentro de la célula y llega al núcleo, para comandar desde allí la producción de los antígenos del patógeno que desencadenarán la respuesta inmune. De esta forma lo que se hace es trasladar la fábrica de la vacuna a los tejidos de la misma persona. Actualmente, se están realizando ensayos de varias vacunas de este tipo, para la hepatitis B, la malaria, la gripe, el herpes simple y el SIDA/VIH.

Vacuna de DNA desnudo: en este tipo de vacunas se utiliza directamente una porción del DNA purificado que contenga el gen de la proteína que produce la respuesta inmune. Esta fracción de DNA se inserta en un plásmido. Las células del paciente vacunado captan ese plásmido y lo incorporan en su núcleo, permitiendo la expresión del gen foráneo y produciendo la proteína recombinante. Esta proteína es secretada al exterior de la célula, por lo cual el sistema inmune puede reconocerla de la misma manera que durante una infección natural, induciendo una respuesta inmune.

Como se vio anteriormente, para el diseño de las nuevas vacunas se parte del conocimiento detallado del genoma del patógeno. Con esta base, se inactivan selectivamente solo aquellos genes no deseados implicados en virulencia, o se potencian aquellas características de inmunogenicidad favorables para la preparación de la vacuna. Al conocer en detalle la composición molecular de la vacuna, se garantiza su seguridad y estabilidad, eliminado los posibles riesgos de introducir microorganismos vivos atenuados. Otras ventajas incluyen la ausencia de riesgos en su producción a escala industrial, ya que no se trabaja en ningún momento con organismos patógenos.

En la actualidad se están llevando a cabo investigaciones en vacunas contra el virus del papiloma Humano HPV (algunos subtipos podrían vincularse con el cáncer de cuello de útero), la malaria (enfermedad que mata a casi tres millones de personas por año), el citomegalovirus (que provoca un síndrome similar a la mononucleosis), la Shigella una bacteria que produce diarrea, el herpes y enfermedades parasitarias como la toxoplasmosis. También se están probando vacunas contra el HIV (virus que causa el SIDA), y contra el cólera o el dengue, y varios tipos de cáncer.

Además del desarrollo de nuevas vacunas, también se están mejorando algunas ya existentes, como la vacuna contra el neumococo (causante de neumonía y meningitis), que abarcará más serotipos de este microorganismo que las vacunas actuales. Al mismo tiempo, se están estudiando vías de administración nuevas, como la nasal (a través de las mucosas) o intradérmicas (en la piel, aunque sin pinchazo). Otra opción muy interesante la constituyen las vacunas que podrían ingerirse con los alimentos o «vacunas comestibles».

Organismos transgénicos

Las técnicas de manipulación genética de la biotecnología moderna han hecho posible modificar la información genética de una serie de organismos animales, apelando a diferentes técnicasy con diferente propósito y resultados. Un organismo transgénicos es aquél que ha sufrido la alteración de su material hereditario (genoma) por la introducción artificial (manipulación genética) de un gene exógeno, esto es, proveniente de otro organismo completamente diferente. Los organismos transgénicos muestran que aparentemente no existen barreras para mezclar los genes de dos especies diferentes.

A mediados de los años sesenta se comenzaron a desarrollar bio-herramientas moleculares con las cuales se podía componer y descomponer al DNA, lo que permitió intercambiar fragmentos específicos de DNA de distintas especies e incluso transferirlos a microorganismos como las bacterias. Después se descubrió que esta práctica la venía haciendo la naturaleza desde hace millones de años con los vegetales a través de la bacteria llamada Agrobacterium tumefaciens.

Animales biofábrica

Un animal biofábrica es aquel al cual se le ha introducido una información genética que le permite sintetizar una determinada proteína por transgénesis. Lógicamente la expresión del gene se efectúa clonándolo en vectores de expresión que contengan promotores y elementos de control de la transcripción que puedan controlar la expresión del gene en un determinado órgano.