Isquemia Normotérmica y Reperfusión de Hígado en Perros

Estudios Experimentales

Evaluación de las Concentraciones Séricas de Enzimas Hepatocelulares

CAMARA NETO R. D., SOUZA A. P, COELHO A. R. B., FERRAZ A. A. B., LIMA FILHO J. F. C., FERRAZ E. M., CAMARA NETO J. B.

Trabajo realizado en el Laboratorio de Cirugía Experimental del Departamento de Cirugía del Centro de Ciencias de la Salud y del Hospital de las Clínicas de la Universidad Federal de Pernambuco, Brasil.

Palabras clave: Hígado, Isquemia, Reperfusión, Descompresión portal, Aspartato aminotransferasa (AST), Alanino aminotransferasa (ALT), Deshidrogenasa láctica (DL), Perros experimentales.

La lesión corriente de isquemia y reperfusión hepáticas normotérmicas ha sido investigada a través de varios modelos experimentales en perros. La intensidad de necrosis hepatocítica ha sido admitida como proporcional al tiempo de isquemia y a la cantidad de hígado desvascularizado. En el presente trabajo, un modelo de isquemia y reperfusión he-páticas en perros fue evaluado a través de enzimas indicativas de necrosis hepatocelular. Veinte perros mestizos con peso corporal de 15.25 ± 1.25 kilos, bajo anestesia general, fueron agrupados de la siguiente manera: 1- Grupo test (n=10), los animales fueron sometidos a desvascularización hepática del 70% durante noventa minutos, con descompresión venosa esplácnica a través de los lóbulos lateral derecho y caudado, seguido de revascularización del hígado.

2- Grupo control (n=10), los perros fueron sometidos a operación simulada. Se determinaron las concentraciones séricas de asparato aminotransferasa, alanino aminotransferasa, deshidrogenasa láctica, 5 minutos antes de la isquemia (To), 5 minutos antes de la revascularización (T1), 1 hora (T2) y 5 horas (T3) después de la revascularización hepática, en la sangre de la vena cava inferior, a nivel de la aurícula derecha. Con una seguridad del 95%, los resultados demostraron que: a) En el período de isquemia no se detectó alteración alguna significativa en las concentraciones de aspartato aminotransferasa, alanino aminotransferasa, deshidrogenasa láctica. b) Después de la reperfusión hepática, hubo aumento significativo y persistente de los niveles de estas enzimas. Los resultados son indicativos de que el tiempo de isquemia y el volumen de hígado desvascularizado fueron capaces de producir la necrosis hepática buscada.

Introducción

La utilización de perros sobre todo cuando se someten a medios de descompresión venosa esplácnica, facilita la investigación de isquemia hepática normotérmica por período de tiempo prolongado (15, 19, 34, 35, 53, 58, 59).

Las lesiones de isquemia y reperfusión hepáticas han sido evaluadas mediante las enzimas comunes de citólisis hepato-celular, tales como: Aspartato aminotransferasa (AST), Alanino aminotransferasa (ALT), y la Deshidrogenasa láctica (DL).

La intensidad de estas lesiones han sido relacionadas no sólo por la cantidad de parénquima hepático sometido a hipoxia tisular, sino también al tiempo de isquemia (14, 47, 53, 58).

El lapso de 90 minutos de isquemia hepática ha sido admitido como suficiente en experimentos in vivo, para ocasionar liberación significativa de enzimas hepatocelulares, indicativas de citólisis, así como también para producir lesión histológica del tipo Necrosis 46. Tal período ha sido admitido como suficiente para la realización de resecciones hepáticas complejas y de anastomosis vasculares durante el trasplante de hígado (4, 31).

En el presente estudio, en el modelo propuesto, la cantidad de tejido hepático sometido a isquemia, estimada entre el 70 y el 75% del total,representada por la suma de los lóbulos hepáticos (LMD, LQ, LME, LLE y PPCC) (13, 22, 41, 42, 44, 54); podría simular guardadas las diferencias en cuanto a la preservación del órgano, situación verificada en el trasplante hepático (2, 7, 8, 10-12, 20, 25, 43, 50, 60).

El presente trabajo, etapa inicial de un proyecto de estudio sobre isquemia y reperfusión hepáticas, pretende en esencia, investigar en un modelo propuesto para perros, resultados de concentración de AST, ALT y DL, antes y después de la inducción de 90 minutos de isquemia, seguida de reperfusión hepática.

Materiales y Métodos

Veinte perros mestizos de ambos sexos con peso corporal de 15.25 ± 1.21 kg, bajo inducción con Tiopental (4 a 6 mgr/kg), fueron intubados y sometidos a respiración controlada con volumen corriente de 15 mL/kg, Fi02 de 21% y frecuencia respiratoria de 16 ciclos/mto. La anestesia gene-ral fue manejada con Cetamina (1 a 2 mg/kg) y Pancuronio (0.1 a 0.2 mg/kg) por vía i.v. Después de abrir la cavidad peritoneal, los animales fueron distribuidos en dos grupos experimentales:

GRUPO TEST (n=10). Los ligamentos hepato-renal, triangular izquierdo, falciforme y gastrohepático fueron des-conectados del hígado. El colédoco, las arterias hepáticas común y gastroduodenal, así como la rama izquierda de la vena porta fueron incluidos, produciéndose de este modo la exclusión vascular normotérmica de los lóbulos medial derecho (LMD), cuadrado (LQ), medial izquierdo (LMI), lateral izquierdo (LLI) y el proceso papilífero del lóbulo caudado (PPLC), por un período de 90 minutos; durante este período, la descompresión del territorio venoso esplácnico fue realizada por la rama derecha de la vena porta, a través del lóbulo derecho y del proceso caudado del lóbulo cuadrado, sometidos apenas a la interrupción del flujo arterial (Figura 1).

El flujo sanguíneo al hígado era restablecido y, luego de la reperfusión, se procedía a la exclusión vascular de los lóbulos hepáticos utilizados para descompresión esplácnica. Después de esos procedimientos, estos lóbulos eran resecados, cauterizándose la superficie hepática con bisturí de argón.

GRUPO CONTROL (n=10). En este grupo, los animales fueron sometidos solamente a disección y aislamiento de los elementos anatómicos del pedículo hepático.

En todos ellos se investigaron en forma sistemática, niveles de concentración de aspartato aminotransferasa (AST – U/L), alanino aminotrasnfersa (ALT – U/L) y deshidrogensasa láctica (DL – U/L), determinados a 5 minutos de isque-mia (T0), 5 minutos antes de la reperfusión hepática (T1), y 15 minutos (T2), 1 hora (T3), 3 horas (T4) y 5 horas (T5) después de la reperfusión del hígado.

Las concentraciones de las ALT y de las AST fueron dosificadas por el método de Reitman y Frankel, y las concentraciones de las DL por el método de Whitaker, en muestras de sangre obtenidas de la cava inferior a nivel del atrio derecho, siendo los resultados expresados en U/L.

En el análisis estadístico realizado con los datos de AST*, ALT* y DL*, se procedió a la aplicación del Test “t” de Student del modo intragrupo e intergrupo. En todo el estudio estadístico el nivel de confiabilidad escogido fue del 95%.

El experimento fue conducido, aplicándose los principios del código de ética para investigaciones biomédicas en animales, de la OMS**.

Resultados

1. Período de isquemia (90 minutos). No se evidenciaron alteraciones significativas entre los niveles medios de las concentraciones de AST, ALT y DL, tanto en el análisis comparativo intragrupo como en aquel realizado entre los grupos, durante el período de isquemia hepática (Tablas 1, 2 y 3).

2. Período de reperfusión (5 horas). En el grupo test, después de la reperfusión hepática, se encontró que a partir del tiempo T2 (15 minutos post-reperfusión) hubo aumento significativo de las concentraciones de AST, ALT y DL, si tomabamos como comparación los niveles medios obtenidos en el tiempo T1 (5 minutos antes de la reperfusión) (Tabla 1). En este mismo cuando se comparó los medios de las concentraciones de estas enzimas, obtenidos en los tiempos T4 y T5, con aquellos verificados en el tiempo T3, no hubo demostración de diferencias estadísticamente significativas (Tabla 1).

En el grupo control, cuando se procedió a la comparación entre los niveles medios de las concentraciones de AST, ALT y DL, obtenidos en los tiempos estudiados después de la reperfusión hepática (T2, T3, T4 y T5) con las medidas de los valores obtenidos antes de la reperfusión (“t”) no se evidenciaron alteraciones estadísticamente significativas. Excepto en relación con AST, en la quinta hora (T5) (Tabla 2).

Durante la fase de reperfusión hepática, el análisis comparativo realizado con los experimentos del grupo test, evidenció aumentos significativos de los valores medios de las concentraciones de AST, ALT y DL, cuando se compararon con aquellos determinados, en tiempos correspondientes, en los experimentos del grupo control (Tabla 3).

Discusión

Enzimas citoplasmáticas capaces de expresar lisis celular, han sido estudiadas en modelos experimentales de isquemia y reperfusión hepáticas siendo consideradas, por tal pro-piedad, como marcadores de lesión de reperfusión hepática. Tales estudios incluyen referencias sobre el aspartato aminotransferasa y/o alanino aminotransferasa (1, 5, 6, 8, 11, 14, 17, 28, 21, 24, 26, 27, 29, 30, 33, 36-38, 40, 41, 45, 47, 50, 52, 57, 59, 60, 61, 63), bien sobre la deshidrogenasa láctica (14, 17, 21, 26-28, 35, 36, 52, 57, 60), en grandes resecciones hepáticas practicadas en humanos (16, 31, 32, 41, 51) y en trasplantes de hígado, clínicos o experimentales (3, 9, 23, 37, 39, 40, 44, 48, 49, 56, 62); las aminotransferasas séricas también han sido utilizadas para calificar la intensidad de isquemia ocurrida.

Las aminotrasnferasas, junto con otros indicadores como las bilirrubinas, volumen de bilis producida y disturbios de coagulación, han sido usados con el objeto de valorar la función inmediata del injerto hepático de trasplantes clínicos, reconociéndose que niveles enzimáticos por encima de 3.000 UI/L son indicativos de ausencia de función, y niveles de 2.000 UI/L sugieren disfunción primaria del injerto.

En el presente trabajo, la sangre para determinación de las concentraciones de las enzimas estudiadas, fue tomada de la vena cava inferior supra-hepática de los animales, utilizándose para eso, el catéter de determinación de presión venosa central, pues ha sido recomendado como el más adecuado para la obtención más precisa de componentes del flujo he-pático (10, 12, 60), evitando o minimizando de este modo los inconvenientes propios de las tomas realizadas en sangre pariférica.

Autores: Renato Dornelas Cámara Neto; Ayrton Ponce de Souza; Antonio Roberto de Barros Coelho; Alvaro Antonio Bandeira Ferraz; José Falcão Corrêa Lima Filho; Edmundo Machado Ferraz; José Bezerra Câmara Neto.

Los valores de las medidas de concentraciones del aspartato aminotransferasa y alanino aminotransferasa, fueron inicialmente transformados en logaritmos neperianos para la obtención de distribuciones Gaussianas y ulterior aplicación del test “(“.
** Howard Jones, N. Acioms: Ethical code .!ÍJr animal experimentatioll. WHO Chronide 1985; 39(2): 51-6.

En los grupos experimentales estudiados, cuando el aspartato aminotransferasa, el alanino aminotransferasa y la deshidrogenasa láctica fueron analizados durante el período de 90 minutos de isquemia hepática, mediante comparación entre la media de los valores de esas enzimas obtenidos en el tiempo T1 y la media de los valores obtenidos en el tiempo T0, no se demostró la existencias de diferencias estadísticamente significativas entre ellas, lo que sugiere que las concentraciones de esas enzimas permanecieron inalteradas durante ese período, posiblemente como resultado del flujo sanguíneo inexistente o mínimo en el área del hígado sometida a isquemia (Tablas 1, 2 y 3). Otros autores también hacen referencia de hallazgos de ese tipo (17, 37, 55).

Así Souza y cols, en estudio de necrosis hepática aguda inducida en perros por isquemia vascular en dos tiempos, observaron niveles de aminotransferasa inalterados en la sangre venosa periférica de los animales, atribuyéndose este resultado a probable inexistencia o existencia mínima de flujo sanguíneo hepático, que impediría el transporte de esas enzimas del hígado hacia la vena cava inferior (55). Esos autores sugieren además, que tal posibilidad llegaría a ocu-rrir aun en presencia de vías sanguíneas accesorias al hígado, siempre y cuando que tales vías fuesen de poca importancia en cuanto al flujo sanguíneo en ellas presente, al punto de no estar capacitadas para facilitar el paso de esas enzimas, en cantidades detectables desde el hígado hacia la circulación sistémica, en tiempos cortos de sobrevida (55).

En los experimentos, cuando se procedió al estudio intragrupo entre las medias de los valores de cada enzima estudiada, obtenidos en los tiempos después de la reperfusión hepática, y las medias de los valores de esas enzimas obtenidos 5 minutos antes de la reperfusión (T1), se comprobó que a partir de los 15 minutos de iniciada la reperfusión (T2), ocurrieron aumentos estadísticamente significativos (Tabla 1). En ese mismo grupo, la comparación entre cada una de las medias de los valores de la aminotransferasa obtenidos en el tiempo T4 y T5, y la media de los valores de esas enzimas obtenidos en el tiempo T3, no demostró que ocurrieran diferencias estadísticamente significativas (Tabla 1). El nivel máximo de elevación de esas enzimas ocurrió en el tiempo T3, permaneciendo estable hasta el final de las verificaciones. El mismo estudio en relación con la deshi-drogenasa láctica, demostró que esta enzima presentó resultados semejantes a los obtenidos con las aminotransferasas (Tabla 1).

En el grupo control, el estudio comparativo entre cada una de las medias de los valores de las enzimas analizadas, obtenidos en los tiempos programados para el estudio durante la fase de reperfusión del hígado y la media de los valores de las referidas enzimas obtenidos en el tiempo T1, no demostró diferencias estadísticamente significativas, excepto con relación a la AST en la quinta hora (Tabla 2).

El análisis comparativo realizado entre los experimentos del grupo test y los del grupo control, demostró la ausencia de diferencias estadísticamente significativas entre ellos, con relación a las concentraciones de AST, ALT y DL, durante el período de isquemia hepática, diferente a lo encontrado con relación a este parámetro durante la fase de reperfusión (Tabla 3).

Los aumentos de esas enzimas verificados en los tiempos programados para el estudio durante el período de reperfusión en los experimentos del grupo test (Tabla 1), pudieron haber sido provocados no solamente por el transporte de las referidas enzimas del hígado lesionado hacia la vena cava inferior durante la recirculación del órgano, además de la acción agravante de la propia reperfusión sobre el tejido hepático ya lesionado por la efectiva isquemia inducida. A propósito, Wu y cols, refieren que las enzimas liberadas por el hígado isquémico alcanzan el nivel máximo en la sangre a los 30 minutos después de iniciada la reperfusión, manteniendo valores aún elevados hasta los 120 minutos de este período. Para esos autores esto representaría evidencia de liberación de enzimas producidas durante el período de isquemia hepática (62). Tales observaciones permiten deducir que en esas circunstancias, los altos niveles de en-zimas después de 120 minutos de recirculación del hígado pudieran estar relacionados con la lesión inducida por reperfusión.

El nivel máximo de elevación de las aminotransferasas y de la deshidrogenasa láctica en el modelo experimental de isquemia y reperfusión del hígado, al igual que en la clínica, parece variar de acuerdo con la especie animal utilizada en el estudio, como también con el tipo y la duración de la isquemia inducida. Así, Peng y cols, estudiando el comportamiento de las enzimas citolíticas en ratones sometidos a isquemia y reperfusión hepáticas, encontraron niveles máximos de la concentración de la ALT en la tercera y quinta hora post-perfusión (50). En esos animales los autores comprobaron que no obstante los niveles de esta enzima descen-dieron después de esos tiempos, permanecieron aún elevados 24 horas después de la recirculación (50). Tomizawa y cols., estudiando ese aspecto en perros, obtuvieron niveles máximos de ALT y DL a los 120 minutos después de iniciada la reperfusión hepática (60). Helling y cols, en estudio de isquemia hepática regional efectuado en cerdos, comprobaron que la AST alcanzó elevación máxima a los 30 minutos de iniciada la recirculación del órgano, seguida de caídas a niveles que se mantuvieron elevados hasta por 24 horas de la reperfusión (28).

Los resultados obtenidos en el presente trabajo, en lo que se refiere a las enzimas séricas investigadas, permiten admitir que el modelo experimental propuesto, fue capaz de inducir isquemia hepática, evitando o minimizando la participación de vías colaterales accesorias en el suplemento sanguíneo del hígado, además de la posibilidad de circulación de sangre entre los lóbulos, debido a la disposición anatómica de la vascularización intrahepática. Esto pudo haber contribuido para que la perfusión hepática indeseada no hubiese ocurrido o, en eventualidad diferente ,se hubiese efectuado con flujo máximo, durante el período de isquemia inducida.

Es pertinente mencionar que la presencia de necrosis a la óptica microscópica de manera significativa y progresiva en los hígados de los animales del grupo test, es también indicativa de que haya sido alcanzada la lesión de isquemia y reperfusión hepáticas que se pretendía en la presente investigación.

Conclusiones

En las condiciones de experimentación del presente trabajo, no se encontraron aumentos significativos en las concentraciones de AST, ALT y DL durante el período de isquemia hepática. Después de la reperfusión del hígado ocurrieron aumentos significativos y persistentes en los niveles de estas enzimas.

Abstract

The ordinary ischemic lesion and the reperfusion normo-thermic injury of the liver have been investigated in various canine experimental models. The severity of hepatic necrosis has been shown to be proportional to the time length of ischemia and to the volume of devascularized hepatic tissue.

We have studied a dog model of ischemia and reperfusion by determination of the levels of enzymes related to hepatic necrosis. Twenty mongrel dogs weighing 15.25 +/- 1.25 Kg were subjected to general anesthesia and divided in two groups: 1 – Test group (n=10), comprised by dogs under-going devascularization of 70% of the hepatic parenchyma for a ninety-minute period, with venous splanchic decompression through the right lateral and caudate lobes,

followed by hepatic revascularization. 2- Control group (n=10), dogs undergoing Sham operation. Determination of serum levels of aspartate aminotranspherase, alanine aminotranspherase, and lactic dehydrogenase were done 5 minutes prior to ischemia (T0), 5 minutes before revascula-rization (T1), 1 hour (T2) and 5 hour (T3) following revascularization, in inferior caval blood samples taken at the level of the right atrium. With a 95% confidence level, our results demonstrated that: a) no significant change of enzyme serum levels was detected during the period of ischemia. b) following hepatic reperfusion there was a significant and persistent rise in the enzyme serum levels. These results are indicative that both the time of ischemia and the bulk of devascularized liver parenchyma were capable of producing the expected degree of hepatic necrosis.

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Correspondencia:
Prof. Edmundo Machado Fecrraz. Rua Dom Debastião Leme, 173/2501 – Graças. CEP-52011-160 – Recife-PE- Brasil. Fax (801) 271-1526 – Fone (081) 423-5394.