Células Tumorales circulantes en la práctica Oncológica

En los tres tumores epiteliales estudiados (mama, colon y próstata), la determinación identifica y cuantifica las CTC en sangre periférica de manera fiable y reproducible. Esto sugiere la utilidad de la técnica y de los resultados, así como su aplicación en el seguimiento y terapéutica. Es importante considerar que en los estudios realizados todos los individuos sanos mostraron menos de 2 CTC en 7.5ml de sangre periférica.

Teniendo en cuenta lo antes mencionado, se ha establecido:

• En cáncer de mama metastático las CTC se asocian a supervivencia, supervivencia libre de enfermedad y predicción de la respuestaterapéutica. (21)

• En cáncer colorrectal metastático las CTC, se asocian a supervivencia y supervivencia libre de enfermedad. En cáncer colorrectal localizado, las CTC predicen el estadío tumoral y son factor pronóstico independiente de SG y SLE. (22)

• En cáncer de próstata metastático las CTC predicen una SLE y una SG más corta. Se ha demostrado una correlación positiva entre el número de CTC y los valores de PSA, con el tamaño del tumor y con la presencia o no de adenopatías. (23) Los hallazgos confirman que las cantidades de CTC antes del tratamiento ayudan a predecir la supervivencia de los pacientes de cáncer de próstata que inician la quimioterapia de primera línea.

Tanto en cáncer de mama, colorrectal y próstata diseminados, los niveles de CTC están significativamente más elevados, sin importar cuál de estos tumores epiteliales estemos evaluando. (24, 25,26)

Detección Mediante Transcriptasa Reversa y Reacción en Cadena de Polimerasa (Rt-Pcr), de Células Tumorales Circulantes

La utilización de la transcriptasa reversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para amplificar el RNAm se presenta como una metodología para la detección de células circulantes derivadas de tumores de órganos sólidos. Las muestras son obtenidas de sangre periférica, los pacientes sanos son los controles negativos y como control positivo se suele utilizar un ganglio linfático afectado por el tumor a estudiar o muestra del tumor (27).

1. La muestra

La muestra de sangre periférica varía de 5 a 10 ml, esta se recoge en tubos de etilenodiaminotetraacetato (EDTA), usualmente 5 tubos y se guardan a una temperatura de 4ºC. Esta muestra debe ser procesada dentro de un periodo de 2-4 horas una vez es extraída.

2. La técnica

La sangre obtenida se centrifuga a 2500 rpm durante 5 minutos, el plasma debe ser desechado y se recoge el suero, este suero se transfiere a un tubo de policarbonato. Posteriormente se le añaden 45 ml de H2O-dietil pirocarbonato (DEP) y PBS- 10X, se agita y se centrifuga a 2500 rpm durante 5 minutos para obtener un pellet exento de glóbulos rojos. Para la extracción del RNA de linfocitos se utilizan diversos Kits comerciales.

Se debe cuantificar el RNA extraído mediante espectrofotómetro de luz ultravioleta a una densidad óptica de 260 nm y 280 nm. Se analiza el RNA mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los geles se visualizan en un transiluminador ultravioleta y son fotografiados.

• Oligonucleótidos:

Son utilizados para amplificar el número de pares de bases del gen estudiado. La integridad del RNA se estudia con los primers correspondientes al DNAc de beta-actina sentido y antisentido. (Los primers elegidos amplifican el número de pares de bases que estamos buscando).

• Transcriptasa reversa:

Las muestras de RNA se incuban con la enzima de transcripción inversa, que ante los cebadores y desoxinucleótidos trifosfatos (dNTP), cataliza la retrotranscripción de las cadenas de DNA complementarias al del RNA (DNAc), la temperatura óptima de transcripción es determinada según el gen estudiado, que por lo general son 42ºC. El proceso se realiza mediante un kit comercial, dondecada tubo de reacción contiene un volumen de 20 μl, compuesto por RNA (1μg), tampón de transcriptasa reversa (100mM Tris-HCl, pH 8.8 a 25ºC, 500mMKCl,Tritón X-100), proteína inhibidora de RNasas (rRNAsin) (0.4μmol), transcriptasa reversa (AMV) (24U), Poli T (oligodT primer) (1mmol), dNTPs (10mM) y agua hasta 20μl. (La transcripción inversa se realiza en un termociclador, donde la temperatura y el tiempo se determina según el tumor a estudio, que suele ser a 42ºC durante 15 minutos).

• Reacción en cadena de la polimerasa:

El resultado de la transcripción inversa se diluye al 1/10 en H2O-DEP, utilizando una alícuota de 5μl para la PCR. Cada tubo de reacción contiene: el resultado de la transcriptasa reversa (5μl), tampón de la enzima Taq polimerasa (10μl), dNTPs (0.2mM), enzima Taq polimerasa (5U/ μl), primer Sense y Antisense del gen tumoral estudiado (1μmol) y agua hasta 100μl.

Los ciclos utilizados para la amplificación del gen se determinan según el gen a estudiar, siguiendo los siguientes pasos: desnaturalización del DNA (1 minuto a 94ºC), acoplamiento de los cebadores y DNA diana (2 minutos) y por último la extensión (3 minutos a 72ºC y 30 ciclos con una extensión final de 7 minutos a 72ºC). (28).

Interpretación de los Resultados

El resultado de la PCR se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%. Para poder extrapolar al tamaño de los fragmentos del DNA estudiado se debe usar un marcador de peso
molecular.

Aplicaciones Clínicas

La utilización de la RT-PCR permite amplificar el RNAm presente en sangre periférica y por tanto es una metodología que se utiliza para detectar pequeñas cantidades de células malignas circulantes en tumores sólidos.

Tiene como inconveniente la pérdida de la información morfológica y el alto porcentaje de falsos positivos observados en los pacientes sanos.

Esta técnica muestra resultados variables en los diferentes estudios, por lo que no ha podido ser reproducible y validada. Está en controversia si con esta técnica se puede predecir el pronóstico y la respuesta terapéutica en los tumores sólidos estudiados (29,30).

Detección de Células Tumorales Circulantes Mediante Microchip

Esta tecnología ha sido desarrollada en el Centro para el Cáncer del Hospital General de Massachusetts, en colaboración con el Centro de Investigación de Sistemas Biomicroelectromecánicos, donde el principio básico es un microchip capaz de aislar, contabilizar y analizar las células tumorales circulantes en sangre periférica (31).

1. La técnica

Consiste en un microchip llamado CTC-chip, que se instala sobre un soporte de tamaño similar al de una tarjeta de crédito; su superficie es de silicona y está recubierto de alrededor de 80.000 puntos detectores microscópicos (micropostes), cargados con anticuerpos capaces de detectar las proteínas (EpCAM) que se expresan en la mayor parte de los tumores sólidos de origen epitelial.

Estos puntos detectores, de una sección inferior a la de un cabello, están dispuestos sobre la superficie del microchip con una geometría tal que al circular la sangre de la muestra entre ellos, con un flujo y una velocidad prefijados por medio de una bomba neumática, capturan las células cancerosas en posiciones determinadas en la tarjeta de silicona dependiendo del anticuerpo con el que está cargado cada punto detector (32).

Esta técnica permite detectar células tumorales con una sensibilidad de una entre mil millones. Y dependiendo del anticuerpo cargado en cada punto detector se fijarán a él células tumorales distintas, por lo que el microchip es capaz de identificar diferentes tumores por su huella molecular. Asimismo, con base en un modelo matemático, se puede constatar el número de células tumorales presentes en la sangre (33).

2. Aplicaciones clínicas

El microchip puede encontrar una de sus mejores aplicaciones en el seguimiento en tiempo real, de la respuesta a las distintas terapias quimioterapéuticas.

En las pruebas clínicas realizadas, se utilizaron muestras de sangre periférica de 68 pacientes afectados por diferentes tipos de tumores sólidos como: pulmón, mama, páncreas, próstata, o colorrectal. Se realizaron en total 116 tests y el microchip detectó con total claridad la presencia de células tumorales en la sangre en 115 de ellos. Los investigadores, con las pruebas realizadas, conceden a este método una fiabilidad del 99%. En los tests de las muestras de sangre de los pacientes sanos en ningún caso se encontraron células tumorales. (34) Serán necesarios varios trabajos adicionales antes de proceder a la aplicación clínica de estos CTC-chips.