Estudio del Ganglio Centinela Después de Neoadyuvancia en Cáncer de Mama, Pacientes y Método

Se estudiaron 31 pacientes diagnosticadas de cáncer de mama invasor. La clasificación de las pacientes se basó en el sistema TNM. El periodo de estudio fue de mayo del 2005 a mayo del 2010. Estas pacientes recibieron cirugía radical con buena migración del marcador durante la determinación del ganglio centinela.

Este estudio fue validado por el comité de ética e investigación clínica del Hospital Clínico San Carlos de Madrid, España (HCSC) y aprobado por el Departamento de Anatomía Patológica y Patología Clínica de la Universidad del Valle, en Cali, Colombia (UV).

Anatomía Patológica: Una vez los ganglios centinelas eran recibidos en el laboratorio de Anatomía Patológica se prepararon según los procedimientos estándares. Cada ganglio linfático se cortaba en dos o más partes entre 1.5 y 3mm.

Los fragmentos del ganglio centinela elegidos para RTPCR no podían haber sido usados en la biopsia por congelación.

Este ganglio era distribuido según el tamaño: un 50% a 75% para Anatomía Patológica y entre un 25% a 50% para la técnica molecular, transportado en solución de guanidina (RNA STAT- 60) al laboratorio de biología molecular.

El fragmento o fragmentos del ganglio centinela fueron fijados con formalina y posteriormente incluidos en bloques de parafina. Una vez en estos bloque, se realizaron un mínimo de 6 niveles por bloque para coloración de H&E y otros seis niveles para realizar el estudio de IHC para citoqueratina AE1-AE3 según los protocolos. (Figura 1)

Las mamas estudiadas fueron revisadas por dos patólogos independientes (HCSC y UV) e incluían variables como: tamaño del tumor, tipo histológico, presencia o ausencia del componente intraductal, porcentaje sobre el total del tumor, grado histológico y nuclear, estado de los márgenes, estado de la piel y músculos profundos, invasión vascular y neural, número de ganglios linfáticos de la linfadenectomía, técnica de IHC, receptores hormonales, Ki67 y HER-2neu.

Molecular: La extracción del RNA de cada una de las muestras se realizó siguiendo las indicaciones del Rneasy Mini Kit (Qiagen).

Un volumen de etanol al 70% era añadido al tejido y posteriormente homogeneizado por medios mecánicos.

La mezcla es añadida a una columna para centrifugar a 8.000 g durante 30 segundos. El RNA queda adherido a la membrana de la columna y es eluido en 50 μl de agua libre de RNasas.

La integridad del RNA se comprobó en gel de agarosa en condiciones desnaturalizantes al 1%. (Lea también: Comparación entre Diferentes Técnicas de Estudio del Ganglio Centinela Después de Neoadyuvancia en Cáncer de Mama)

Solo las muestras que presentaban las bandas 28S y 18S del RNA ribosómico eran usadas en las técnicas de RT-PCR. Para la determinación de mamaglobina y CK-19 se emplearon 5 μl de RNA.

Los primeros empleados en la RT-PCR fueron: Sense 5’CAA ACG GAT GAA ACT CTG AGC AAT GTT GA y AntiSense 5’TCT GTG AGC CAA AGG TCT TGC AGA en el caso de la mamoglobina A y Sense: 5’AGA TGA GCA GGT CCG AGG TTA y AntiSense 5’ CCT GAT TCT GCC GCT CAC TAT CA en la determinación de la CK-19 (10).

En la amplificación se empleó una concentración final de 400 μM de dNTP y 0.6μM de cada uno de los primers. Se realizó la retrotranscripción y la amplificación en una sola reacción.

El análisis de los productos amplificados se realizó en un gel de poliacrilamida al 12 %.(Figura 2)