Glifosato y otros Plaguicidas y Evaluación del Daño en el ADN

En Trabajadores que Laboran en Cultivos de Caña de Azúcar en el Valle del Cauca

3.6. Recolección de la información

3.6.1. Diseño de instrumentos

– Encuesta ocupacional. Se aplicará a cada uno de los trabajadores seleccionados en la muestra por medio de un formulario con información general como identificación, edad, sexo y antecedentes ocupacionales como tipo de oficio, tiempo de exposición en el oficio, utilización de elementos de protección personal, medidas de higiene y seguridad industrial, exposiciones extralaborales, antecedentes patológicos como: enfermedades recientes, exposición a radiaciones, tratamientos con radioterapia o quimioterapia; antecedentes toxicológicos como condición de fumador, consumo de alcohol, exposición a otros tóxicos ambientales, signos y síntomas compatibles con intoxicación por el herbicida glifosato y plaguicidas organofosforados, carbamatos y organoclorados y hábitos alimenticios.

– Medición del glifosato y su metabolito AMPA. La determinación se realizará por cromatografía líquida de alta eficiencia con detector de espectrometría de masas. (Lea también: Proyecto de Investigación: Determinación de la Exposición a Glifosato y otros Plaguicidas)

– Niveles de organofosforados, carbamatos y organoclorados en sangre mediante cromatografía de gases. El análisis se realiza por extracción en fase sólida (SPE) utilizando discos de C18 en muestras de sangre. Posteriormente se realiza el análisis cromatográfico por los sistemas HRGC/ECD y HPLC/UV.

– Estudio de las alteraciones en el material genético. Determinación de la frecuencia de Micronúcleos (MNs).

Se realizará cultivo de linfocitos para la determinación de la frecuencia de Mns según la técnica de Fenech y Morley9.

Determinación de las rupturas en el ADN

– Ensayo del cometa (SCG)
Se realizará en sangre total, según la técnica descrita por Sing y colaboradores10.

3.6.2. Técnica de recolección

– Encuesta ocupacional. Estará a cargo de profesionales del área de la salud (médicos/microbióloga) quienes aplicarán la encuesta a cada uno de los trabajadores seleccionados en la muestra. Antes de iniciar la fase de recolección de la información se dará una inducción a los profesionales encargados de realizar la encuesta ocupacional.

Se elaborará un instructivo como guía para el adecuado diligenciamiento de ésta encuesta, realizándole los ajustes necesarios a éste instrumento después de llevar a cabo el estudio piloto.

– Medición del glifosato y su metabolito AMPA. Dentro de los cinco primeros días después de la exposición a glifosato se recolectará orina de una micción (aproximadamente 50 ml) en frascos de polipropileno con tapa rosca; una vez tomada la muestra deberá permanecer congelada (en nevera) hasta su envío al laboratorio donde serán procesadas.

– Niveles de organofosforados, carbamatos y organoclorados en sangre mediante cromatografía de gases. Se recolectara un total de 12ml de sangre en tubos de ensayo con anticoagulante heparina, de los cuales 6 ml de sangre se emplearan para el análisis de organofosforados, carbamatos y organoclorados. Las muestras se recolectarán máximo a las 72 horas de exposición a estos plaguicidas y permanecerán refrigeradas hasta su envío al laboratorio donde serán procesadas.

La recolección y rotulado de la totalidad de las muestras de sangre estará a cargo de un profesional (médico/ microbióloga) vinculado a alguna de las instituciones participantes.

Cada paciente será codificado con el número correspondiente a la encuesta ocupacional. Una vez lleguen las muestras al laboratorio, serán recodificadas con el fin de minimizar el sesgo del analista, por una persona distinta a éste y al investigador.

– Estudio de las alteraciones en el material genético. Determinación de la frecuencia de Micronúcleos (MNs). A partir de la muestra de sangre total de 12 mL, se tomarán 5 ml para la determinación de micronúcleos y del índice de división nuclear.

Se realizará el cultivo de linfocitos en medio RPMI 1640 suplementado en condiciones de esterilidad, 45 horas después de la iniciación de éste, se adicionará Citocalascina B (0,5 mL a una concentración de 6 ugr/mL).

La presencia de micronúcleos indicará fragmentos de cromosomas o cromosomas completos que no han quedado incluidos dentro del núcleo. Se continuará la incubación durante 30 horas más. Se realizarán extendidos de las células cosechadas en láminas portaobjetos y se colorearán con una solución Wright-Giemsa.

Se realizará el conteo de todas las células, observando la lámina con objetivo de 40X, clasificándolas de acuerdo al número de núcleos, hasta obtener 2000 células binucleadas, en las cuales se observarán los MNs.

Los criterios de selección para el conteo de MNs serán los siguientes:

• Se deben analizar células con citoplasma y núcleo intactos.
• Diámetro menor de 1/3 del núcleo principal. El tamaño promedio de los micronúcleos es de 2 a 4 micras de diámetro.
• No refractibilidad (excluir pequeñas partículas teñidas).
• Mismo color o ligeramente más claro que el núcleo e igual textura (excluir grandes partículas teñidas).
• Localización dentro de 3 ó 4 diámetros nucleares sin tocar el núcleo (separación física del núcleo principal).
• No más de 2 micronúcleos asociados con un núcleo (si 3 o más micronúcleos aparecen con un núcleo, probablemente son polimorfos).
• Se deben excluir aquellas células con gránulos positivos en el citoplasma o aquellos con evaginaciones nucleares.
• Cuerpos redondos separados del núcleo principal (evaginación).

Para cuantificar la progresión celular en el cultivo, se calcula el Indice de División Nuclear (IDN), el cual describe el número de veces que en promedio la célula se ha replicado, a partir del número relativo de células mononucleadas (N1), binucleadas (N2), trinucleadas (N3) y tetranucleadas (N4)55,56.

IDN = (1 x f N1)+(2 x f N2)+(3 x f N3)+(4 x f N4) / N
Donde:
f = frecuencia de células
N1-N4 = número de células con uno a núcleos respectivamente
N= total de células observadas.

La frecuencia de micronúcleos se relaciona con cada una de las variables: nivel de exposición, sitio de trabajo, género y edad, y se utiliza la prueba estadística de Kruskal-Wallis.

Determinación de la ruptura en el ADN – Ensayo Cometa (SCG)

A partir de muestra de sangre total se tomará 1 ml para realizar el ensayo cometa. Se realizará la técnica basada en el protocolo de Sing y col10.

Las células nucleadas son colocadas dentro de un gel de agarosa sobre láminas de microscopio, lisadas por detergentes a altas concentraciones salinas y luego sometidas a electroforesis bajo condiciones alcalinas. La corriente eléctrica empuja el ADN cargado negativamente del núcleo hacia el ánodo. Las pequeñas piezas de ADN dañado migran más rápido.

Visto en el microscopio de fluorescencia, el ADN parece un cometa con una cabeza brillante y una cola cuya longitud e intensidad son indicativas de la cantidad de daño producido. Haciendo uso de un microscopio de fluorescencia y de una coloración con bromuro de etidio se observa la migración monocatenaria del ADN desde el núcleo. El daño del ADN es directamente proporcional al largo de las colas de migración.

Para el análisis de las láminas se establecerán los criterios según el nivel de daño del ADN y basados en la técnica de Sing y colaboradores10. Mediante observación en el microscopio de fluorescencia dotado de un filtro cuya longitud de onda sea de 515-560 nm (filtro verde), usar una magnificancia de 250X para hacer la valoración del daño del ADN.

La lectura será realizada teniendo en cuenta los siguientes criterios:

• Valoración del daño por porcentaje así:

Menor de 5%: No daño
5% – 20%: Daño bajo
20 – 40%: Daño medio
40 – 95%: Daño alto
Mayor de 95%: Daño

• Medición de la longitud de las colas de migración haciendo uso de un micrómetro. Las láminas serán codificadas de forma que todos los análisis serán hechos en test ciego.

3.7. Estudio piloto

Se llevará a cabo en un 10% del total de la muestra, en donde se realizará la prueba de formularios, con el objeto de hacer posteriormente los ajustes necesarios tanto de instrumentos como de tiempos y movimientos. Las personas participantes en el estudio piloto no formarán parte de la población muestra seleccionada en el estudio.

3.8. Criterios de inclusión

Los criterios para la aceptación de trabajadores expuestos serán tiempo de trabajo ininterrumpido en cultivos de caña de azúcar mínimo de 6 meses a partir de la fecha de la toma de la muestra, trabajadores que estén expuestos a plaguicidas, que voluntariamente acepten participar y firmen el consentimiento informado.

Los criterios de inclusión de individuos no expuestos, serán los mismos para los individuos expuestos, excepto no tener exposición a plaguicidas ni haber laborado en cultivos de caña de azúcar en los últimos 6 meses a partir de la fecha de la toma de la muestra.

3.9. Criterios de exclusión

Los criterios de exclusión incluyen antecedentes de enfermedades crónicas que requieran terapias o medicamentos durante largo tiempo (inmunosupresores), uso de agentes quimioterapéuticos, tratamientos con radioterapia y exposición a rayos X en los últimos 6 meses. Además aquellos individuos que voluntariamente no deseen participar en el estudio serán excluidos.

3.10. Procesamiento de los datos

Toda la información será sistematizada en una base de datos en el programa Epi-Info 6.04 para su posterior análisis.

3.11. Metodología del análisis

Se relacionarán las características sociodemográficas, ocupacionales, clínicas y toxicológicas de la población objeto con las mediciones de glifosato, organofosforados, carbamatos y organoclorados y las determinaciones de los efectos genotóxicos (micronúcleos, ensayo del cometa e índice de división nuclear) con el fin de obtener datos acerca de la exposición a estas sustancias.

Se utilizará el programa Epi-info, donde se creará una base de datos para cada individuo participante en el estudio a partir del cuestionario diseñado, empleando para el análisis el mismo programa. Inicialmente se observarán las distribuciones de frecuencia de cada variable usando promedio, mediana y desviación estándar y luego se procederá a elaborar tablas agrupadas para las mismas frecuencias.

Los análisis estadísticos a realizar en las pruebas de los efectos genotóxicos son:

Prueba de Kruskal-Wallis
Regresión lineal
Análisis de Varianza – Coeficiente de dispersión H
Prueba de X2

El apareamiento del grupo seleccionado será por edades de ± 5 años de diferencia en el grupo de expuestos y no expuestos, se tendrá en cuenta el género. Este estudio permitirá plantear nuevos estudios con base en los resultados obtenidos.

3.12. Consideraciones éticas

Se le informará a la Secretaría de Salud del Valle del Cauca y a Asocaña el tipo de estudio que se va a realizar y se seleccionará la población muestra con la ayuda de estas entidades.

Antes de iniciar la recolección de la información y de las muestras, se informará a los trabajadores los objetivos y el tipo de estudio que se llevará a cabo, la importancia y beneficios que les traerá el participar, aclarándoles que se les entregarán los resultados de las pruebas paraclínicas.

A cada trabajador se le proporcionará una hoja de consentimiento la cual deben firmar antes de contestar las preguntas de la encuesta ocupacional y de la toma de muestras biológicas. Los resultados de las pruebas serán entregados a cada uno de los trabajadores participantes en el estudio por un profesional médico quien explicará los hallazgos.

Los trabajadores que lo ameriten serán remitidos a la EPS correspondiente con el fin de definir la conducta médica a seguir; en caso de que no tengan EPS el seguimiento se hará a través de la Secretaría de Salud.

Teniendo en cuenta la Resolución 8430 de 1993 del Ministerio de Salud que establece las normas académicas, técnicas y administrativas para la investigación en salud, en el Titulo II Capitulo I Artículo 11 sobre los aspectos éticos de la investigación en seres humanos, se clasifica esta investigación como de riesgo mínimo.

Bibliografía

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3. Insectos Asociados con la Caña de Azúcar en Colombia [online]. Lastra L, Gómez L. Cenicaña. Disponible en: https://www.cenicana.org/pdf/documentos_no_seriados/libro_el_cultivo_cana/libro_p237-263.pdf
4. Burger M, Fernández S. Exposición al herbicida glifosato: aspectos clínicos toxicológicos. Rev Med Uruguay 2004; 20:202-207.
5. Estudio de los efectos del programa de erradicación de cultivos ilícitos mediante la aspersión aérea con el herbicida glifosato (PECIG) y de los cultivos ilícitos en la salud humana y en el medio ambiente. Solomon K, Anedón A, Cerdeira A, Marshall J, Sanín L. CICAD, 2005. Disponible en: https://www.cicad.oas.org/es/glifosatoInformeFinal.pdf
6. Henao S, Corey G. Plaguicidas inhibidores de las colinesterasas. Serie Vigilancia 11. Centro Panamericano de Ecología Humana y Salud, Organización Panamericana de la Salud, Organización Mundial de la Salud. México, 1991.
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8. Cassaret L., Doull J. Toxicology, The basic science of poisons. Macmillan Publishing Co. Fourth edition. New York, USA 1991.
9. Fenech M, Morley AA. Measurement of micronuclei in lymphocytes. Mutat Res 1985; 147:29-36.
10. Sing NP, McCoy MT, Tice RR, Schneider EL. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res 1988; 175:184-191.