En el mercado existe el filtro ISET (Isolation by Size of Epithelial Tumour cells), donde los poros del filtro son de 8 μm, pero se observa que los leucocitos de mayor tamaño quedan atrapados en el filtro, por lo que es considerada una técnica con buena sensibilidad y baja especificidad (35).
1. La técnica microfiltro
Se basa en un dispositivo microfiltro desarrollado por un equipo de la Escuela Keck de Medicina de la Universidad del Sur de California, en Los Ángeles, en colaboración con el Instituto de Tecnología de California, en Pasadena. Con esta técnica se capturan las CTC en virtud de su tamaño, basándose en el principio de que la célula tumoral es mucho más grande que sus contrapartes. Se tarda en promedio 90 segundos para procesar 7,5 ml de sangre periférica (36).
2. Aplicaciones clínicas
Esta técnica microfiltro se encuentra todavía en una fase temprana de desarrollo y requiere más trabajo y la validación analítica. Por ejemplo, la tasa a la cual la sangre es empujada a través del filtro tendrá que ser normalizada (37).
Detección de Células Tumorales Circulantes a Través de Citometría de Flujo
La citometría de flujo es una tecnología que permite la medición simultánea de múltiples características físicas y químicas de las células en suspensión. El citómetro permite conocer información sobre las células estudiadas en cuanto a su tamaño, su granularidad o complejidad interna y evaluación química (38).
1. La muestra
La muestra corresponde a 100μl de sangre total, 10μl del marcador determinado, se incuba de 10-15 minutos a temperatura ambiente, se añade el lisador y se lleva al equipo.
2. La técnica
Utiliza un sistema óptico-electrónico donde se registra cómo la célula interactúa con un rayo láser. Con esta técnica se detecta la capacidad de la célula para desviar la luz incidente (láser) y emitir fluorescencia. Además de detectar moléculas específicas celulares como anticuerpos conjugados o antígenos específicos de epitelios (intracelulares) en el caso de las CTC (39,40). Los marcadores usados para CTC son citoqueratinas y mucin-1, los cuales no se encuentran en los precursores hematopoyéticos.
Componentes: un sistema de fluidos, un sistema óptico compuesto por una fuente de luz y de separación espectral, un sistema electrónico con un control mecánico de luz y detectores, un sistema de colección y análisis de pulsos, además de un sistema informático, el cual analiza y presenta los datos de las células estudiadas (41).
3. Aplicación clínica
Aunque las aplicaciones más relevantes están relacionadas con la hematología e inmunología clínica, esta técnica utilizada para determinar las CTC tiene la ventaja de que las células no se lisan y por ello se conserva la morfología con la tipificación posterior. (42) Su aplicación clínica en tumores epiteliales sólidos aun no se encuentra estandarizada. Otros estudios de investigación han demostrado que la citometría de flujo multiparamétrica tiene muy buena sensibilidad con una mínima cantidad de 10 células por mililitro de sangre periférica, en un volumen total de 10 ml. (100 células en total) (43).
Detección de Células Tumorales Circulantes a Través del Sistema Fast- Citométrico
(Fiber-optic array scanning Technology)
1. La muestra
La muestra corresponde a 10 ml de sangre periférica.
2. La técnica
Esta técnica utiliza marcadores de inmunohistoquímica: CK (citoqueratinas) característica de la célula epitelial y DAPI para la determinación nuclear, con estos marcadores se tipifican las CTC en sangre periférica (44,45). Las CTC son captadas a través del FAST scanning y se observan con el microscopio de inmunofluorescencia a 40X, buscando las células con fenotipo DAPI y CK positivas. Posteriormente se observan con la coloración de Wright-Giemsa, a través de un microscopio óptico (46). Con esta técnica se evalúa pleomorfismo, se determina el cociente núcleo/citoplasma y se observa la cromatina de las CTC.
3. Aplicación clínica
Esta técnica ha sido utilizada para determinar la presencia de las CTC de tumores sólidos, especialmente en cáncer de mama, enfocada en estudiar las características citomorfológicas de las CTC e investigar nuevas dianas terapéuticas. Aún falta realizar estudios clínicos para que esta técnica sea validada (47,48).
Detección de Células Tumorales Circulantes a Través de Fish
(Hibridación in situ fluorescente)
1. La técnica
Esta técnica utiliza moléculas fluorescentes para poder localizar genes o fragmentos de DNA de la CTC. Se preparan cortas secuencias de DNA, llamadas sondas, las que son complementarias de las secuencias de DNA, según el tumor sólido a estudiar. Estas sondas son marcadas con fluorocromos y posteriormente se hibridan al DNA complementario, permitiendo así localizar las secuencias en las que se encuentran. Se aplica sobre las CTC y se observa la fluorescencia al microscopio de epifluorescencia (49). Lo que se pretende observar son cambios citogenéticos según el tipo de CTC estudiada; la presencia de deleciones, traslocaciones o amplificación de genes específicos en los cromosomas de las CTC.
2. Aplicación
Es un método validado para la genotipificación de las CTC, lo que ha permitido estudiar y ampliar conceptos en la genética del cáncer (50).
