El Diagnóstico en avicultura Ayuda o laberinto

Trabajo complejo, el diagnóstico en la avicultura exige responsabilidad del técnico que toma y envía las muestras al laboratorio, y de este, que lo realiza. Escribe Néstor A. Mossos C. DMV, PhD., del Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario del Instituto Colombiano Agropecuario, ICA.

La sanidad es uno de los pilares de la productividad en la industria avícola, y en los procesos de apertura de mercados, esta se constituye en una de las barreras más importantes para el comercio internacional. Ahora bien, cuando se menciona el diagnóstico es importante considerar que éste no solamente está dirigido a identificar una problemática infecciosa, sino que también tiene que ver con establecimiento de problemas distintos a los ocasionados por agentes microbiológicos; tal es el caso del manejo, presencia de tóxicos y aspectos nutricionales, entre otros.

Al remitir al laboratorio una muestra para diagnóstico, con el resultado obtenido sólo se va a conocer parte de la problemática, ya que en muchos casos el diagnóstico está relacionado de manera directa con fallas que únicamente se pueden identificar cuando se hace la visita a la granja y se tiene la oportunidad de observar in situ el comportamiento de los animales y las posibles causas (factores de riesgo) responsables del problema. El diagnóstico no presencial realizado por el laboratorio puede complementarse, en parte, con el envío de una detallada historia clínica que permita inferir la situación de campo y contribuir a la emisión del diagnóstico final.

En avicultura, la definición del diagnóstico es muy compleja, ya que la mayoría de los problemas son de tipo multifactorial y sus soluciones responden igualmente a la aplicación de un conjunto de medidas que lleven a corregir los factores primarios o secundarios responsables de los mismos. Con mucha frecuencia, el laboratorio percibe la renuencia de los productores o técnicos a enviar una historia completa que oriente el diagnóstico, recibiéndose escasamente un historial relacionado sólo con la especie, edad y línea productiva.

Es así como, en la mayoría de ocasiones, el laboratorio emite sólo un resultado puntual, pero no el diagnóstico, el cual es la esencia del envío de una muestra al laboratorio. Las empresas y granjas se llenan de estos datos, los que por lo demás, no son analizados y registrados en bancos que provean información, contribuyéndose en muy pocos casos a la solución de una problemática. A la luz de estas apreciaciones, avicultor y técnico pueden estar soslayando un recurso importante, al no darle trascendencia a la investigación epidemiológica que es esencial en la medicina preventiva. Esta dificultad se hace también patente cuando se desarrollan estudios epidemiológicos de campo para determinar la condición de una enfermedad en particular, en los cuales si la información que se suministra es deficiente o errónea, lleva a que los resultados obtenidos mediante los análisis de correlación o interacción carezcan de toda lógica, perdiéndose un conocimiento valioso de la problemática en una zona, región o país.

Por otra parte, para que un diagnóstico sea realmente confiable, se necesita, además de la correcta y completa información, una toma adecuada de muestras, que obedezca a la condición sanitaria de la granja y a la sospecha del problema por investigar por parte del técnico. Es frecuente que la toma de muestras sea realizada por personas indoctas sobre el conocimiento médico de las características de la enfermedad, por lo que se envía al laboratorio material que no corresponde a las aves o lotes afectados para las pruebas solicitadas o al momento en el que se encuentra la enfermedad.

En avicultura, es muy frecuente la interacción de agentes primarios con secundarios, como es el caso de las infecciones respiratorias virales complicadas con agentes bacterianos; también se presenta la interacción entre agentes primarios: Bronquitis infecciosa con Newcastle. Es así como, fácilmente se puede tener la participación de tres o más agentes en una problemática, lo que ha sido establecido reiterativamente en diferentes investigaciones realizadas.

Al solicitarse un examen de laboratorio para un agente específico, se puede omitir el análisis de otros agentes, ya sean primarios o secundarios, que son necesarios de identificar para realizar las correcciones pertinentes y poder solucionar un problema. Esto se aprecia, por ejemplo, cuando se solicita el diagnóstico de Newcastle en presencia también de Bronquitis infecciosa o Gumboro. En estos casos es probable que la causa primaria pueda ser una inadecuada respuesta inmunológica ocasionada por algún agente inmunodepresor. Al tomar las medidas correctivas dirigidas únicamente a controlar Newcastle, puede que se solucione una parte de la problemática que se refleja en reducción de la morbilidad y mortalidad, pero la problemática de base permanecerá en la granja y seguirá actuando de manera cíclica y con mayor impacto productivo.

Como recomendación general, las muestras de sangre enviadas para estudio serológico deben ser tomadas de los lotes, corrales o grupos de aves en los que se iniciaron los signos clínicos, ya que en estos es más probable encontrar títulos sospechosos de la enfermedad, que en los lotes en los cuales la enfermedad apenas está iniciando. Igualmente, para realizar aislamiento viral es más recomendable que las muestras se envíen de lotes en los que la enfermedad está en la fase aguda, cuando hay menos contaminación secundaria, mayor replicación del agente infeccioso y este aún no ha sido neutralizado por los mecanismos de defensa de las aves.

El estudio histopatológico es un instrumento valioso, que posibilita el diagnóstico temprano de un sinnúmero de patologías en diferentes especies animales. Sin embargo, al igual que la serología, es una herramienta que debe ser analizada con alguna reserva y bajo ciertas consideraciones. Las lesiones histológicas se presentan en fases tempranas de la enfermedad y son las que van a ocasionar la muerte de los animales. En algunos casos, como en Marek o Leucosis, el desarrollo es más de tipo crónico y requiere, por tanto, mayor tiempo para ver las lesiones, mientras que en otros cuadros patológicos la observación de la lesión corresponde más a las secuelas de la enfermedad o de los agentes secundarios. Cuando la enfermedad cursa con la presencia de cuerpos de inclusión, como es el caso de la Laringotraqueitis y Hepatitis, estos pueden desaparecer después de unos días y la lectura va a ser sólo de la lesión avanzada y muchas veces complicada por otros agentes.

El aislamiento viral es un método directo de diagnóstico que permite realizar estudios posteriores de caracterización o identificación de un agente. Es importante recordar que los virus vacunales también pueden circular en una granja y que estos pueden ser reaislados cuando se envían muestras para este fin. El aislamiento viral debe ser realizado por laboratorios que cuenten con sistemas adecuados de bioseguridad, para evitar que los agentes aislados se puedan diseminar fuera del laboratorio y ser trasportados a las granjas. Igualmente, estos deben contar con sistemas confiables de aislamiento, tales como cultivos celulares primarios, líneas celulares o embriones de pollos libres de patógenos. En la medida en que se garantice la calidad de estos medios de aislamiento se aumenta la confiabilidad del resultado.

Ahora bien, el aislamiento de un agente viral por sí mismo no indica necesariamente, como ya se mencionó, su responsabilidad en el problema, ya que este puede corresponder a virus vacunales o ser virus asociados a otros agentes de mayor importancia.

Con el fin de determinar con precisión el tipo de agente y su papel como patógeno, es necesario realizar estudios de caracterización, mediante pruebas complementarias, que de no hacerse, llevarían a que el resultado fuera equivalente a una serología, en la que se establece la presencia del agente, pero se desconoce su papel como patógeno en la granja.

Uno de los mecanismos desarrollados para determinar las características de los agentes virales o bacterianos aislados está representado por las pruebas moleculares, las que permiten el estudio del DNA y realizar la comparación entre los virus utilizados en las vacunas con los encontrados en las diferentes zonas o regiones del país e incluso con los aislados de otros países. El método más conocido para este fin es el de PCR, mediante el cual, además de detectar la presencia de pequeñas cantidades de virus, se pueden establecer comparaciones entre los mismos, aplicando la técnica de PCR-RFLP. Estas técnicas, aunque ya se encuentran ampliamente difundidas, requieren personal especializado para su ejecución y más aun para la interpretación de los resultados, puesto que el producto obtenido es visual y no cuantitativo con lo cual se facilitan los errores de apreciación. Igualmente, de no contarse con los espacios adecuados en el laboratorio pueden presentarse contaminaciones durante el proceso o ejecución de la técnica. En ocasiones, los resultados pueden también no ser concluyentes, siendo necesario entrar a cuantificar y determinar la composición exacta de las secuencias de los fragmentos de DNA, para lo cual se requieren procesos aun más especializados y costosos, como la secuenciación.

Se concluye, por lo tanto, que para llegar a un diagnóstico en avicultura es fundamental allegar la información relacionada y aplicar procedimientos adecuados para la toma de las muestras en las granjas, su correcto envío al laboratorio y la decisión oportuna sobre las técnicas más adecuadas por realizar, todo lo cual permite la interpretación correcta de los resultados y su relación con la situación de campo, para tener al final el diagnóstico sobre el cual se tomen las medidas correctivas para la solución del problema.

Técnica para la detección de Salmonella Rápida y en tiempo real

Disponible en el país técnica de biología molecular de gran velocidad y alta sensibilidad de la prueba. Artículo de Elizabeth Vásquez Cedeño, MSc., asesora técnica de la Línea de Moleculares, de Roche S.A.

Salmonella es uno de los principales patógenos de la industria avícola en el mundo y una de las causas principales de infecciones en humanos transmitidas por alimentos contaminados, en especial, si se trata de alimentos de origen animal (carne, pollo, leche, huevos), aunque otros alimentos, incluyendo, vegetales también pueden contaminarse.
Por este motivo la prevención de infecciones por salmonella es importante, no sólo para la industria avícola, sino para la seguridad de la industria alimentaria y, por ende, de la salud humana. Esta prevención sólo puede lograrse a través de programas de seguimiento y tamizajes eficientes.

Elizabeth Vásquez Cedeño

La detección de salmonella por los métodos microbiológicos tradicionales usualmente requiere entre 5 y 7 días, así como animales con un número de células bajo de salmonella pueden carecer de síntomas clínicos, lo que puede dar origen a resultados falsos negativos. Por este motivo, los esfuerzos de los laboratorios de diagnóstico han sido encaminados a reducir el tiempo requerido para la realización de la prueba y a incrementar la sensibilidad de los métodos para detectar salmonella en muestras avícolas.

Las técnicas de biología molecular han comenzado a utilizarse en los laboratorios de diagnóstico en los últimos años, y más específicamente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha tenido una gran implementación tanto por la velocidad como por el nivel de sensibilidad de la prueba. Otra ventaja es que la PCR no es dependiente de la utilización de un sustrato o la expresión de antígenos, por lo que se evitan variaciones fenotípicas en los patrones bioquímicos y en lo niveles de antígenos indetectables por pruebas inmunológicas.

Por estas razones, la PCR se ha comenzado a utilizar para la identificación de muchas especies microbianas en los laboratorios. Por ejemplo, se ha implementado su utilización a partir de muestras incubadas en caldos de preenriquecimiento para el diagnóstico especifico de salmonella en humanos y animales, como en muestras fecales y de alimentos, y el método ha demostrado ser más rápido y confiable porque incrementa la sensibilidad con respecto a la prueba tradicional.

Básicamente, la técnica de PCR consiste en amplificar un gen específico del microorganismo a partir de una muestra biológica (caldo de preenriquecimiento, cultivos, hisopos cloacales, etc.) en tres etapas: denaturación (separación del ADN en cadenas sencillas), anillaje (unión de los cebadores al ADN blanco) y extensión (sintetizar una copia del ADN blanco) que conforman un ciclo, el proceso se repite unos 35 ciclos y al final se obtienen millones de copias del gen que se deseaba amplificiar. Finalmente, se realiza la detección del gen por medio de un gel de electroforesis.

Actualmente, existe una nueva innovación de la PCR tradicional que se denomina PCR en tiempo real, que consiste en realizar el proceso de amplificación y detección simultáneamente a una mayor velocidad y de manera automatizada. Es decir, que desde el comienzo de la amplificación de manera on-line se van observando los resultados. Lo que mejora aun más la velocidad y la sensibilidad de una prueba de diagnóstico para cualquier microorganismo.

El LightCycler Salmonella Detection Kit permite detectar 1 UFC (unidad formadora de colonia) en menos de 24 horas requiriendo de 16 a 20 horas de pre-enriquecimiento y únicamente 2 horas adicionales para la preparación de la muestra y obtención de resultados por medio de la técnica de PCR en tiempo real, aumentando la sensibilidad y la especificidad con respecto a los métodos tradicionales.

De otro lado, el kit simplifica el uso de la PCR por combinar todos los reactivos necesarios en una mezcla maestra de PCR, incrementando la reproducibilidad del análisis, debido a que minimiza los pasos de la prueba, parte de que facilita la realización de la misma sin previos conocimientos en técnicas de biología molecular.

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N. de la D.: La bibliografía de este trabajo se encuentra disponible en Avicultores.